慢病毒转染类器官的方法与用途技术

本申请提供了一种慢病毒转染类器官的方法与用途，通过改变培养条件，使用慢病毒转染前先通过孔径不小于70μm滤网控制类器官球大小尽量均一化，然后将细胞均匀铺于超低吸附培养板中，超低吸附细胞培养板可以让细胞自发形成均匀大小和形状的球状体，能最大限度地减少细胞附着，在后续的转染过程中最大限度还原细胞3D状态下的转染，既提高效率也尽可能保持所有细胞3D的状态。同时增加离心转染25min~35min，提高转染效率，有助于后续病毒的转染。本申请通过用慢病毒载体转染类器官，转入的基因能够在类器官中稳定地表达，类器官也能稳定地生长和传代，具有转染效率高、细胞存活率高等技术效果。等技术效果。等技术效果。

【技术实现步骤摘要】
慢病毒转染类器官的方法与用途


[0001]本申请属于基因工程和细胞工程领域，涉及一种慢病毒体外高效转染类器官的方法。

技术介绍

[0002]细胞转染是指将外源分子导入真核细胞内以改变其基因型或表型能力的一种技术。转染的主要目的是通过增强或抑制特定基因在细胞中的表达，研究基因的功能或基因产物。根据导入的成分，转染可分为病毒转染和非病毒转染。非病毒转染包括物理和化学方法的转染，其代表性的方法分别有电穿孔法和脂质体转染法。病毒转染中根据病毒的类型包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。病毒的转染效率比常规真核表达载体高很多，特别适合介导外源基因在难转染甚至无法转染的哺乳动物细胞中表达。
[0003]类器官（Organoids）是一类由干细胞，包括多能干细胞和成体干细胞在体外培养时形成的具有一定空间结构的组织类似物。肿瘤类器官（Tumor Organoids）由术后或活检肿瘤组织在体外培养时形成的，保留自身肿瘤组织3D结构，以及各项肿瘤学特征的微型培养物。通俗讲，肿瘤类器官即经体外3D培养的微肿瘤（Patient
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derived organoids，PDOs）。类器官与传统细胞系模型相比，能高度还原来源肿瘤的组织形态和遗传特点。同时，类器官比人源性组织异种移植（PDX）模型操作更简便高效。类器官作为新一代人源化模型，能够更加真实地模拟组织器官在体内的细胞组成、生理功能和遗传特征，在临床医学和生命科学领域发挥重大作用。
[0004]传统技术中的腺病毒转染不能整合到细胞的基因组，无法稳定地表达，因此，腺病毒不适合做较长时间的细胞研究。现有的研究中使用慢病毒转染类器官的方法各有差异，存在转染效率不稳定或者细胞状态发生变化等技术缺陷。

技术实现思路

[0005]基于此，本申请提供一种慢病毒转染类器官的方法，以解决现有的慢病毒转染类器官存在效率不稳定以及细胞状态发生变化的问题。
[0006]本申请的技术方案是，提供一种慢病毒转染类器官的方法，包括以下步骤：步骤S1取待转染的类器官进行消化处理，将所述类器官的组成细胞分散，过滤。
[0007]步骤S2、将过滤收集的细胞于超低吸附培养容器中培养。
[0008]步骤S3、培养后加入MOI为0~20的慢病毒的病毒液后进行离心转染。
[0009]步骤S4、转染后孵育预设时间，去慢病毒后接种至基质胶内进行培养，2~3天换一次液，待类器官状态良好，筛选得慢病毒转染的类器官。
[0010]其中，步骤S1中所述过滤为采用孔径不小于70μm的滤网进行过滤，步骤S3中所述离心转染条件为400g~600g，28℃~35℃，转染25min~35min。
[0011]在其中一个实施例中，步骤S1中所述过滤为采用孔径70μm~100μm的滤网过滤。
[0012]在其中一个实施例中，步骤S3中所述离心转染条件为500g，32℃转染30min。
[0013]在其中一个实施例中，步骤S1中所述消化处理为采用胰酶进行处理。
[0014]在其中一个实施例中，所述胰酶的工作浓度为0.25w/v%~5w/v%。
[0015]在其中一个实施例中，步骤S3在离心转染时还向病毒液中加入polybrene辅助感染试剂。
[0016]在其中一个实施例中，加入在病毒液中的所述polybrene辅助感染试剂的终浓度为6μg/mL~10μg/mL。
[0017]在其中一个实施例中，步骤S4中采用嘌呤霉素作为筛选试剂进行筛选，可选地，嘌呤霉素的终浓度为2μg/mL。
[0018]在其中一个实施例中，所述类器官为肿瘤类器官。
[0019]本申请另一方面提供一种慢病毒转染的类器官，该类器官的制备方法包括上述的慢病毒转染类器官的方法中的步骤。
[0020]本申请通过改变培养条件，使用慢病毒转染前先通过孔径不小于70μm的滤网控制类器官消化后的分散球大小尽量均一化，然后将细胞均匀铺于超低吸附培养容器中培养。一方面，超低吸附细胞培养容器可以让细胞自发形成均匀大小和形状的球状体，能最大限度地减少细胞附着，在后续的转染过程中最大限度还原细胞3D状态下的转染，既提高效率也尽可能保持所有细胞3D的状态；另一方面，通过一定时间的培养使消化后的细胞（团）恢复状态利于提高后续转染的效率。此外，同时增加离心转染25min~35min，有助于提高转染效率。本申请通过用慢病毒载体转染类器官，转入的基因能够在类器官中稳定地表达，类器官也能稳定地生长和传代，具有转染效率高，细胞也具有较高存活率等技术效果。
附图说明
[0021]图1为本申请使用的Lenti
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SpCas9
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Puro
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Tomato Red慢病毒载体系统的设计示意图，其中，LTR：长末端重复序列；CMV：巨细胞病毒启动子；SpCas9:一种高效、精准的基因编辑载体，它是基于最新一代的人工核酸内切酶 CRISPR/Cas9而研发而来，该载体含有一个敲除插入位点，仅靠单个载体就可以完成基因组DNA的编辑；EF1：启动子；Puro：puromycin抗性基因；T2A：能够在翻译后水平上自我剪切，保证目的蛋白与荧光蛋白同等水平翻译；Tomato:能发出红色荧光的蛋白基因。
[0022]图2为过表达相关基因的表达情况，其中，Cas9为目标蛋白，GAPDH为内参蛋白。
[0023]图3为荧光显微镜下蛋白表达情况。
[0024]图4为基于类器官的TP53基因失活突变结果，其中，TP53WT为TP53Wild Type野生型组，TP53Target组为TP53靶向敲除组，control为未处理组，Nultin
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3为药物处理组。
具体实施方式
[0025]下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可
以无需一个或多个这些细节而得以实施。
[0026]除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的
的技术人员通常理解的含义相同。
[0027]术语本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、取待转染的类器官进行消化处理，将所述类器官的组成细胞分散，过滤；步骤S2、将过滤收集的细胞于超低吸附培养容器中培养；步骤S3、培养后加入MOI为0~20的慢病毒的病毒液后进行离心转染；步骤S4、转染后孵育预设时间，去慢病毒后接种至基质胶内进行培养，2~3天换一次液，待类器官状态良好，筛选得慢病毒转染的类器官；其中，步骤S1中所述过滤为采用孔径不小于70μm的滤网进行过滤，步骤S3中所述离心转染条件为400g~600g，28℃~35℃，转染25min~35min。2.根据权利要求1所述的慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，步骤S1中所述过滤为采用孔径70μm~100μm的滤网过滤。3.根据权利要求1所述的慢病毒转染类器官的方法，其特征在于，步骤S3中所述离心转染条件为500g，32℃转染30min。4.根据权利要求1所述的慢病毒转染类器官的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：余磊，陈洁琳，傅超群，余建辉，黄奕锟，吴万军，
申请(专利权)人：深圳明澳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：