一种测定血清中人源UKLK1的ELISA方法技术

本发明专利技术涉及一种测定血清中人源抗体的ELISA方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术针对人源抗原与UKLK1孵育结合，然后加入标记KLK1检测抗体，再加入SA

【技术实现步骤摘要】
一种测定血清中人源UKLK1的ELISA方法


[0001]本专利技术涉及一种测定血清中人源抗体的ELISA方法，尤其涉及一种测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，属于生物医药


技术介绍

[0002]人尿激肽原酶(U
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KLK1)主要成分为激肽原酶，系从人尿中提取精制的一种由238个氨基酸组成的糖蛋白。激肽原酶(kiniogenase)又叫激肽释放酶(kallikrein),是激肽原酶
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激肽系统(KKS)的一个组成成员。KKS在激肽乳动物中广泛存在，与体内多个信号系统有密切的联系。KKS系统的组成有以下几个部分: 激肽原、激肽原酶、激肽、激肽酶、激肽受体和激肽原酶抑制剂。激肽原在激肽原酶的作用下，释放出激肽。激肽通过与激肽受体结合，产生下泳的信号传导途径，发挥各种生理功能。激肽可被激肽酶降解。激肽原酶可被激肽酶制剂所抑制。
[0003]激肽原酶分为血浆激肽原酶(PK)和组织激肽原酶(TK)。血浆激肽原酶存在于血浆中。组织激肽原酶广泛存在于人体肝、肾、脑等器官和唾液、血浆、关节液、脑脊液等各种体液中。组织激肽原酶的分布比血浆激肽原酶广泛，主要在组织中合成。这一类激肽原酶在人体中已经发现15种，位于同一染色体上，但是只有组织型激肽原酶1（hK1）具有催化激肽原水解产生激肽的作用。其催化的活性位点组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸分别位于hK1编码基因的1、3、5外显子。人尿激肽原酶（尤瑞克林），实际上就是分泌到尿液的组织型激肽原酶1（hK1）。
[0004]hK1最早发现在肝中合成，其英文名kallikrein，就是取希腊文“肝”的词根而起的，即在肝里产生的蛋白酶。血浆中的hK1主要来自肾，其次是动脉平滑肌细胞和中性粒细胞，另外一些细胞也释放hK1。人尿里的激肽原酶有50%是有活性的，另50%是以酶原形式存在。一价或二价阳离子抑制人尿激肽原酶的活性。
[0005]hK1是酸性蛋白，pI约4.0，分子量24
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45kD，长238AA，单链。肝与肾的组织激肽原酶1在162位具有多态性。唾液腺的组织激肽原酶1在121位和162位也具有多态性。KLK1蛋白产物具有三个天冬氨酸连接的N糖链和三个O糖链，糖基占20%。糖链上的唾液酸对该酶的热稳定性起到重要作用。hK1以前体的形式（preprokallikrein）产生，信号肽长17个AA。Preprokallikrein从细胞中分泌出来时，信号肽被切掉，成为酶原形式（prokallikrein）。从酶原形式到活性形式，prokallikrein要被切掉7个氨基酸。这个过程可能发生在细胞内的高尔基体或分泌泡内；也可能发生在细胞外，即分泌出细胞后，被激活的组织激肽原酶所激活，或被其它有胰酶特性的酶激活。血浆激肽原酶和纤溶酶都可激活hK1，但效率不高。因此，血浆中的hK1以三种形式存在：活性形式、酶原形式，还有一种形式是与α1
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抗胰蛋白酶结合的复合体形式。
[0006]市场上尤瑞克林(uKLK1)用于轻
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中度急性血栓性脑梗死的作用靶点是激肽释放酶
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激肽系统(kallikrein
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kinin system，KKS)。研究表明，在脑缺血急性期，KKS激活参与侧支小血管的迅速开放，改善缺血区血流灌注并抑制神经细胞的凋亡；在脑缺血恢复期，
KKS激活对缺血区血管新生和神经元再生具有促进作用，KKS还可减少梗死后的细胞凋亡、减弱脑内的氧化应激反应、增加胶质细胞的存活和迁移。尤瑞克林是从尿液中提取出的一种组织性激肽释放酶(tissue kallikrein，TK)，它通过催化激肽原产生胰激肽、之后在激肽酶1的作用下产生一个九肽调节物，从而靶向性的作用于缺血部位的B1受体，选择性地扩张脑部细微动脉，改善缺血区的血供和氧供；同时还能促进缺血区新生血管的生成。
[0007]在世界范围内，急性缺血性脑卒中（AIS）仍是导致死亡和残疾的主要原因。而最严重的后果则是由于脑底动脉环（Willis环）内的主要分支血管堵塞造成的。当前，针对大血管闭塞，西方国家主要的治疗策略是通过使用机械或药物方法（例如，组织血浆激活剂；tPA）去除有问题的血凝块来快速恢复血流。KLK1负责生成激肽（缓激肽和胰激肽），促进局部血管扩张和长期血管形成。此外，KLK1现已被临床用于直接治疗包括AIS在内的与局部血流障碍相关的多种疾病。目前，中国已经批准从人尿中分离出的一种人KLK1用于AIS的亚急性治疗。
[0008]市场上的现有试剂盒均为重组Human KLK1，对UKLK1特异性不好，从而导致无法正确测定。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是针对现有技术存在无法正确测定UKLK1的缺陷，提出一种测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，提高检测特异性与灵敏度。
[0010]本专利技术通过以下技术方案解决技术问题：首先是定量测定血清中UKLK1的ELISA方法，包括如下步骤：步骤1）用抗人UKLK1 抗原包微孔板(Anti
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UKLK1)，得到包被后的微孔板；步骤2）将待测UKLK1样品加入抗原包被的微孔板中孵育结合，形成“抗原
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抗体”复合物；步骤3）加入UKLK1(Labelled UKLK1)检测抗体，所述抗原包被的微孔板中与抗原
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抗体复合物孵育结合，形成“抗原
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抗体
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检测抗体”复合物；步骤4）加入Streptavidin
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HRP标记的亲和素所述抗体包被的微孔板中与“抗原
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抗体
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检测抗体”复合物孵育结合，形成“抗原
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抗体
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检测抗体
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SA
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HRP标记的亲和素”复合物，加入底物TMB显色；步骤5）终止液终止反应，测定OD值；步骤6）通过UKLK1标准曲线计算待测样品在血清中UKLK1浓度。
[0011]以上方法的步骤1）中，所述UKLK1抗源浓度为0.5μg/mL～2.5μg/mL；优选地，所述UKLK1的浓度为1μg/mL；用Anti
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UKLK1抗原包微孔板，得到包被后的微孔板在4～8℃放置≥16小时，放置后的微孔板加入封闭液，并且在37℃孵育2小时；步骤2）中，所述己知UKLK1抗体浓度配制在混合小鼠血清标准曲线范围，75pg/mL～8000pg/mL；质量控制样品范围400～4000ng/mL。
[0012]步骤3）中，所述Labelled UKLK1检测抗体浓度为0.5μg/mL～4μg/mL；优选地，所述Labelled 2μg/mL。
[0013]步骤4）中，所述SA
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HRP标记的亲和素1:50～1:800；优选地，所述SA
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HRP标记的亲和素1:200。所述加HRP酶的底物(TMB)入显色时间5～20分钟；优选地，所述TMB底本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，包括以下步骤：步骤1) 用抗人Anti
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UKLK1抗原包微孔板，得到包被后的微孔板，人源Anti
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UKLK1浓度为0.5μg/mL～2.5μg/mL，包被后的微孔板在4～8℃放置≥16小时；在放置后的微孔板中加入封闭液，并在37℃孵育2小时；步骤2) 将UKLK1和待测样品加入抗体包被的微孔板中孵育结合，形成抗原
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抗体复合物；步骤3) 将抗体Anti
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UKLK1(Labelled antibody)加入所述抗体包被的微孔板中与抗原
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抗体复合物孵育结合，形成抗原
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抗体
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检测抗体复合物，UKLK1(Labelled UKLK1)检测抗体浓度为0.5μg/mL～4μg/mL；步骤4）将Streptavidin
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HRP标记的亲和素加入所述抗体包被的微孔板中与抗原
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抗体
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检测抗体复合物孵育结合，形成抗原
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抗体
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检测抗体
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HRP标记的亲和素复合物，加入底物显色，Streptavidin
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HRP标记的亲和素1:50～1:800，加入HRP酶的底物TMB显色时间5～20分钟；步骤5) 加入终止液终止反应，测定OD值；步骤6) 通过UKLK1标准曲线计算待测样品在血清中UKLK1浓度。2.根据权利要求1所述测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，其特征在于：所述步骤1）中人源Anti
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UKLK1浓度为1μg/mL，所述封闭液为2%BSA
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PBS溶液。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：山莽挺，
申请(专利权)人：南京广祺医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：