一种人五毛滴虫LFD-RPA的可视化核酸检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种人五毛滴虫LFD

【技术实现步骤摘要】
一种人五毛滴虫LFD
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RPA的可视化核酸检测试剂盒


[0001]本专利技术公开一种人五毛滴虫LFD
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RPA的可视化核酸检测试剂盒，本专利技术还提供了该试剂盒的检测方法，属于生物检测


技术介绍

[0002]人五毛滴虫（Pentatrichomonashominis）是呈世界性分布的一类人兽共患寄生虫，主要寄生在人和脊椎动物的结肠和盲肠内。人五毛滴虫感染引起以腹泻为主要症状的人五毛滴虫病，感染后还会导致肺部感染、风湿性关节炎等疾病，且人五毛滴虫感染与胃肠道癌症有密切关系。目前诊断动物感染人五毛滴虫的方法主要包括直接涂片镜检法、染色镜检法、PCR检测法等。但镜检法检出率不高。PCR检测法需要借助一些特殊的实验器械且步骤复杂。
[0003]重组酶聚合酶扩增(RecombinasepolymeraseamplificationRPA)是近年来发展起来的一种快速诊断的方法，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断中。RPA利用重组酶可与引物紧密结合，形成重组酶
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引物复合物，促进引物与DNA双链的同源靶序列的结合，DNA聚合酶进行新链的合成，整个过程仅需在37
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42℃下反应10
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30分钟即可。与PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，时间较短。重组酶聚合酶扩增侧流层析技术(LFD
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RPA)是RPA技术结合侧流层析试纸条(LateralflowdipsticksLFD)建立的一种现场快速检测系统，特别适用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。目前，尚无动物人五毛滴虫感染LFD
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RPA的可视化核酸检测方法的报导。

技术实现思路

[0004]本专利技术公开了一种人五毛滴虫LFD
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RPA的可视化核酸检测试剂盒，以RPA等温扩增技术原理结合侧流层析试纸条建立动物人五毛滴虫感染核酸检测技术，不依赖大型仪器，实现快速、易操作的检测。
[0005]本专利技术所述的一种人五毛滴虫LFD
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RPA的可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：1）试剂盒中包括含RPA冻干颗粒的反应管、反应缓冲液ABuffer、扩增试剂BBuffer、两对引物和探针以及ddH2O和侧流层析试纸条；其中：所述RPA冻干颗粒反应管的组分包括：重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及外切酶；所述的两对引物及探针如下：上游引物：5'
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ATAGTGGTGGACGAGCCCTGGATTGCCTTG
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3'；下游引物：5'
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Biotin
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CTTGTGCCAATCTCATAAAAACGCTCTCCT
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3；探针：5'
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[6
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FAM]‑
GACGTGTAGTTCCAATACCAGCTTCACCAGATGG[THF]CATAAAAGCAGTTAGATGTACA
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[C3Spacer]‑
3'；在RPA试剂盒中的终浓度为2μM；2）试剂盒中还应包含：阳性对照的DNA模板为感染人五毛滴虫粪便基因组DNA；阴
性对照的为未感染人五毛滴虫粪便基因组DNA，用于比较RPA产物以及监测RPA操作过程是否有污染；所述试剂盒25μL反应体系如下：12.25μL的A Buffer，2μM上下游引物各0.6μL，2μM探针0.25μL，ddH2O7.55μL，待检人五毛滴虫DNA模板2.5μL及1.25μL的B Buffer。 1）本专利技术所述的一种人五毛滴虫LFD
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RPA的可视化核酸检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1）提取待检样品的总DNA；2）RPA扩增：将上游引游5'
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ATAGTGGTGGACGAGCCCTGGATTGCCTTG
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3'；下游引物5'
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Biotin
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CTTGTGCCAATCTCATAAAAACGCTCTCCT
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3，探针5'
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[6
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FAM]‑
GACGTGTAGTTCCAATACCAGCTTCACCAGATGG[THF]CATAAA AGCAGTTAGATGTACA
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[C3 Spacer]‑
3'，RPA反应缓冲液，总DNA模板混合于RPA扩增试剂的反应管中配置成扩增反应体系，RPA反应体系为25μL，包含：12.25μL的A Buffer，2μM上下游引物各0.6μL，2μM探针0.25μL，ddH2O7.55μL，待检人五毛滴虫DNA模板2.5μL及1.25μL的B Buffer；涡旋混匀后瞬时离心，在反应温度为35
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40℃，反应时间为15min条件下进行重组酶聚合酶扩增；3）LFD检测RPA扩增产物：利用侧流层析试纸条检测RPA扩增产物，将扩增产物稀释8倍至225μL，扩增产物取10μL滴加于样品垫上，然后滴加10μL试纸条缓冲液于样品垫上，室温下反应2min，肉眼观察结果；若试纸条质控线、检测线均显色出现紫色条带，则表明RPA扩增产物为阳性，样品中含有人五毛滴虫DNA；若质控线出现条带，检测线无条带出现，则表明RPA扩增产物为阴性，样品中无人五毛滴虫DNA；若质控线未显色，则实验结果无效。
[0006]本专利技术结合RPA技术及侧流层析试纸条法建立了人五毛滴虫核酸可视化快速敏感检测方法，通过引入羧基荧光素（FAM）标记的探针及生物素(Biotin)标记的引物，在RPA反应过程中，探针与扩增产物结合，当探针被内切酶内切后，与生物素(Biotin)标记的引物共同扩增产生大量一端FAM标记、另一端生物素标记的双链DNA产物。RPA反应液滴加于样品垫时，标记有FAM和生物素的扩增产物与纳米金偶联抗体及检测线上的生物素配体形成复合物使纳米金聚集显色，出现检测线。试纸条上的质控线包被有FAM二抗，可与游离的FAM探针及FAM抗体标记的纳米金粒结合而显色，出现质控线，以指示结果的有效性。
[0007]本专利技术的积极效果在于：以RPA等温扩增技术原理结合侧流层析试纸条建立动物人五毛滴虫感染核酸检测技术，结合RPA技术及侧流层析试纸条法建立了人五毛滴虫核酸可视化快速敏感检测方法，本专利技术以RPA等温扩增技术原理结合侧流层析试纸条建立动物人五毛滴虫感染核酸检测技术，不依赖大型仪器，实现快速、易操作的检测，具体优点表现在以下几点：1.节约时间：反应快速，整个实验过程只需要15min，该时间远远低于巢式PCR的2h；2.降低反应温度：反应温度范围宽，常用温度与室温接近，在恒温35℃即可完成实验，该温度远远低于巢式PCR的60℃
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95℃；3.方法简单且试剂盒便于携带：本专利技术提供的LFD
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RPA检测方法及试剂盒操作简
单，无需特殊仪器设备，可肉眼观察结果。扩增所需要的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与人五毛滴虫SPO11
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1基因有关的引物与探针在检测人五毛滴虫感染中的应用，其特征在于：1）提取人五毛滴虫基因组DNA，利用下述引物扩增人五毛滴虫SPO11
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1基因，下游引物5'端由生物素Biotin化修饰；上游引物：5'
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ATAGTGGTGGACGAGCCCTGGATTGCCTTG
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3'；下游引物：5'
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Biotin
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CTTGTGCCAATCTCATAAAAACGCTCTCCT
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3；2）探针序列中5'端由羧基荧光素FAM修饰，相关G碱基被[THF]残基取代，3'端由C3
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Spacer修饰；探针：5'
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[6
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FAM]
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GACGTGTAGTTCCAATACCAGCTTCACCAGATGG[THF]CA TAAA AGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张西臣，陈雪娇，张楠，李建华，宫鹏涛，王晓岑，李新，张旭，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：