本发明专利技术提供一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法。为了解决现有PLA2R重组蛋白活性低且产量不高的问题，本发明专利技术提供的制备方法包括如下步骤：(1)将表达所述磷脂酶A2受体重组蛋白的核酸在原核细胞中表达蛋白；(2)采用重复冻融法和盐酸胍溶液重悬法提取原核细胞中表达的蛋白，(3)对步骤(2)所得的蛋白进行复性，得到所述磷脂酶A2受体重组蛋白，其中，步骤(1)中，所述核酸编码的蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明专利技术的制备方法制备的PLA2R重组蛋白活性与天然PLA2R蛋白相当，与抗PLA2R自身抗体的免疫反应性优于全长天然磷脂酶A2受体蛋白，该制备方法产量高，表达流程短，重复性佳。重复性佳。
【技术实现步骤摘要】
一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法
[0001]本专利技术涉及抗原制备
，具体涉及一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法。
技术介绍
[0002]磷脂酶A2受体(PLA2R)是I型跨膜受体蛋白，其是哺乳动物的4个甘露糖受体中的一个。PLA2R是一个表达在人足细胞上分子量为185kDa的蛋白，PLA2R蛋白仅在细胞膜上存在，不跟随身体系统循环流动。大部分PLA2R蛋白结构暴露在细胞外且其胞外区域包含一个保守域，此外PLA2R包含一个跨膜区域和C端的细胞内域。PLA2R的细胞外域中含有N端多半胱氨酸域，纤维粘连蛋白二型重复域，以及8个连续的碳水化合物识别域。PLA2R持续通过细胞内吞作用使其蛋白构型保持一种回收模式，以便使PLA2R能与其他配体形成化合物并展露在免疫系统下。PLA2R的免疫原性取决于蛋白内的二硫键的正确配对与形成。
[0003]PLA2R的生理作用虽还未完全得到解析，但其临床意义与膜性肾病相关，至少有70％的膜性肾病患者的样本内检测得到针对PLA2R的自身抗体。由此引发膜性肾炎会诱发针对人体足细胞的自身抗体的推测，PLA2R抗体可成为膜性肾病诊断标志物之一。
[0004]PLA2R抗体的检测结果的可靠性以及检测成本的高低与诊断试剂核心原料PLA2R抗原息息相关。PLA2R是跨膜蛋白，表达难度高，表达量低，膜蛋白从细胞膜面分离难度高，纯化步骤复杂。通过真核细胞表达是常用的表达手段，但是真核细胞表达量较低无法难足大批量生产的需求。原核细菌表达体系虽然表达量高，但是由于PLA2R蛋白的活性严重依托正确的蛋白内二硫键形成，而原核生物表达得到的PLA2R重组蛋白几乎为错误折叠不具蛋白天然活性的包含体或杂蛋白。因此，如何在保证PLA2R重组蛋白具有PLA2R蛋白天然活性的同时提高生产效率是研究的重点。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，该制备方法具有更高的生产效率且制备的磷脂酶A2受体重组蛋白具有PLA2R蛋白天然活性。
[0006]本专利技术的另一目的是提供通过上述制备方法制备得到的磷脂酶A2受体重组蛋白。
[0007]本专利技术的另一目的是提供一种用于检测抗磷脂酶A2受体抗体或用于检测与抗磷脂酶A2受体抗体阳性相关的疾病的试剂盒。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0010](1)将表达所述磷脂酶A2受体重组蛋白的核酸在原核细胞中表达蛋白；
[0011](2)采用重复冻融法和盐酸胍溶液重悬法提取原核细胞中表达的蛋白，
[0012](3)对步骤(2)所得的蛋白进行复性，得到所述磷脂酶A2受体重组蛋白，
[0013]其中，步骤(1)中，所述核酸编码的蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其至少具有95％的同源性，
[0014]步骤(3)中，所述复性采用的复性溶液的配方为：40～80mM Tris，80～150mM精氨酸，200～300mM氯化钠，0.005％～0.02％(g/v)P300防腐剂，余量水。
[0015]优选地，步骤(1)中，所述核酸编码的蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0016]优选地，所述核酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其至少具有95％的同源性。
[0017]根据一具有实施方式，所述核酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0018]优选地，步骤(1)中，所述原核细胞为大肠杆菌。
[0019]优选地，步骤(2)中，所述盐酸胍溶液的配方为：4～8M盐酸胍，200～300mM氯化钠，余量水；采用碱性物质调节所述盐酸胍溶液pH值为5.5～6.5。
[0020]优选地，步骤(3)中，所述复性的方法为：将步骤(2)所得的蛋白和所述复性溶液按照体积比为1：40～60混合，同时滴加还原性麸胱甘肽至其终浓度为0.05～0.2M，混匀后滴加氧化性麸胱甘肽至其终浓度为0.02～0.03M，室温静置15～20小时。
[0021]优选地，所述制备方法还包括对步骤(3)得到的所述磷脂酶A2受体重组蛋白进行纯化的步骤，所述纯化的步骤为将所述磷脂酶A2受体重组蛋白依次经镍离子亲和纯化柱、阳离子交换层析柱和分子筛层析柱。
[0022]根据一些实施方式，所述纯化步骤具体包括：
[0023]S1：将步骤(3)得到的所述磷脂酶A2受体重组蛋白透析到磷酸缓冲液中，然后过镍离子亲和纯化柱，接着使用磷酸缓冲液冲洗柱子，再使用第一解离液洗脱蛋白得到蛋白初步洗脱液，所述第一解离液的配方为：100～150mM氯化钠，2～3.5mM氯化钾，5～15mM磷酸氢二钠，1～2.5mM磷酸二氢钾和200～300mM咪唑；
[0024]S2：将步骤S1得到的蛋白初步洗脱液透析到pH值为5～6的MOPS缓冲液中，然后过阳离子交换层析柱，接着使用MOPS缓冲液冲洗柱子，再使用第二解离液洗脱蛋白得到蛋白二次洗脱液，所述第二解离液的配方为：40～60mM MOPS，0.5～1.5M氯化钠，余量水；采用碱性物质调整所述第二解离液的pH值为5.5～6.5。
[0025]S3：将步骤S2得到的蛋白二次洗脱液透析到磷酸缓冲液中，然后过分子筛层析柱，接着使用磷酸缓冲液冲洗柱子，收集分子量为75kDa的蛋白，即为纯化后的所述磷脂酶A2受体重组蛋白。
[0026]根据一些实施方式，经所述纯化步骤后的所述磷脂酶A2受体重组蛋白封存于蛋白保存液中，所述蛋白保护液的配方为：40～60mM Tris，150～250mM氯化钠，15～25mM精氨酸，0.5～1.5％(v/v)甘油，0.01％(g/v)P300防腐剂，余量水。
[0027]根据一些实施方式，步骤(1)具体为：将所述核酸克隆到pET
‑
26b质粒中，然后电转染大肠杆菌，电转染后的大肠杆菌采用LB琼脂糖培养至大肠杆菌的OD600值达到0.5～0.6后，加入IPTG后继续培养2～5小时；
[0028]步骤(2)具体为：将步骤(1)得到的大肠杆菌菌液在5000～10000rpm离心去除上清液，将菌体沉淀用液氮速冻后放入30～40℃水浴解冻，重复以上速冻解冻流程2～4次后，采用所述盐酸胍溶液重悬，重悬后以8000～12000rpm离心，收集上清液。
[0029]本专利技术还提供一种磷脂酶A2受体重组蛋白，所述磷脂酶A2受体重组蛋白由所述的制备方法制备得到。
[0030]本专利技术还提供一种用于检测抗磷脂酶A2受体抗体或用于检测与抗磷脂酶A2受体抗体阳性相关的疾病的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的磷脂酶A2受体重组蛋白。
[0031]优选地，所述的试剂盒为化学发光检测试剂盒。
[0032]优选地，所述的试剂盒的检测样本类型为血清、血浆或全血中的一种或多种。
[0033]优选地，所述的与抗磷脂酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：(1)将表达所述磷脂酶A2受体重组蛋白的核酸在原核细胞中表达蛋白；(2)采用重复冻融法和盐酸胍溶液重悬法提取原核细胞中表达的蛋白，(3)对步骤(2)所得的蛋白进行复性，得到所述磷脂酶A2受体重组蛋白，其中，步骤(1)中，所述核酸编码的蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其至少具有95％的同源性，步骤(3)中，所述复性采用的复性溶液的配方为：40～80mM Tris，80～150mM精氨酸，200～300mM氯化钠，0.005％～0.02％(g/v)P300防腐剂，余量水。2.根据权利要求1所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述核酸编码的蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和/或，所述核酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其至少具有95％的同源性。3.根据权利要求1所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述原核细胞为大肠杆菌。4.根据权利要求1所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述盐酸胍溶液的配方为：4～8M盐酸胍，200～300mM氯化钠，余量水；采用碱性物质调节所述盐酸胍溶液pH值为5.5～6.5。5.根据权利要求1所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述复性的方法为：将步骤(2)所得的蛋白和所述复性溶液按照体积比为1：40～60混合，同时滴加还原性麸胱甘肽至其终浓度为0.05～0.2M，混匀后滴加氧化性麸胱甘肽至其终浓度为0.02～0.03M，室温静置15～20小时。6.根据权利要求1所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括对步骤(3)得到的所述磷脂酶A2受体重组蛋白进行纯化的步骤，所述纯化的步骤为将所述磷脂酶A2受体重组蛋白依次经镍离子亲和纯化柱、阳离子交换层析柱和分子筛层析柱。7.根据权利要求6所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述纯化步骤具体包括：S1：将步骤(3)得到的所述磷脂酶A2受体重组蛋白透析到磷酸缓冲液中，然后过镍离子亲和纯化柱，接着使用磷酸缓冲液冲洗柱子，再使用第一解离液洗脱蛋白得到蛋白初步洗脱液，所述第一解离液的配方为：...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛霄鹏，安鹏远，
申请(专利权)人：迪亚莱博张家港生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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