一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌种的长期保藏方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs

【技术实现步骤摘要】
一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs
‑
4菌种的长期保藏方法


[0001]本专利技术涉及微生物保藏
，具体讲是一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs
‑
4菌种的长期保藏方法。

技术介绍

[0002]冬虫夏草为冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是一种传统的名贵中药材，在中国已有千年的历史。发酵虫草菌粉Cs
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4为中国医学科学院药物研究所从天然冬虫夏草中分离所得的蝙蝠蛾拟青霉(Cs
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4)经深层发酵，产物经过滤干燥制成，经研究与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，为可替代天然虫草的虫草制品。其制剂药品金水宝胶囊为国家中药一类新药，临床应用广泛。蝙蝠蛾拟青霉(Cs
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4)菌种被列为国家保密菌种。
[0003]菌种保藏是根据菌种的生物学特性，人为创造条件尽量降低微生物菌体的代谢活动，以达到延长生命、减少变异的目的。目前常用的菌种保藏方法有：低温定期移植法、石蜡油低温保藏法、甘油管保藏法、液氮超低温保藏法等。不同的保藏方法都有各自的优势与缺陷。发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs
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4)菌种是一种大规模产业化生产用菌种，其菌种保藏与其他目的菌种保藏要求有所不同。发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs
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4)菌种保藏是要使菌种生产能力和与生产工艺相适应的优良性状保持稳定，在长期的保藏过程中力求把菌种衰退现象推迟或减缓到最低限度。因此，为了避免由于菌种保藏导致的菌种发酵性能退化，使得产品收率及质量产生波动，降低对产品一致性造成不良影响，寻找一种适合发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs
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4)菌种长期保藏方法是十分必要的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs
‑
4菌种的长期保藏方法。
[0005]本专利技术的技术解决方案如下：
[0006]一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs
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4菌种的长期保藏方法，包括以下步骤：
[0007]S1：配制复合冷冻保护剂，灭菌后备用；
[0008]S2：制备菌体孢子悬浮液，并将菌体孢子悬浮液与步骤S1中的复合冷冻保护剂混合，分装入灭菌后的安瓿管中，封口；
[0009]S3：将步骤S2的安瓿管预冻，预冻后，将安瓿管进行冷冻干燥；
[0010]S4：将步骤S3的安瓿管装入多歧管，抽真空后，用火焰熔封，得到待保藏样品；
[0011]S5：将步骤S4的待保藏样品放置于低温环境中长期保藏。
[0012]进一步地，所述步骤S1中，复合冷冻保护剂为脱脂牛奶、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、甘油中的一种或几种。
[0013]进一步地，所述步骤S2中，菌体孢子悬浮液的浓度为108～10
10
个/ml。
[0014]进一步地，所述步骤S2中，菌体孢子悬浮液与复合冷冻保护剂按体积比1:1～2混
合。
[0015]进一步地，所述步骤S3中，预冻温度为
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20℃～
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30℃，时间10～15h；冷冻干燥温度为
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40℃～
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50℃，时间10～20h。
[0016]进一步地，所述步骤S5中，低温环境温度为2℃～8℃。
[0017]进一步地，所述步骤S5中，长期保藏的年限至少为15年。
[0018]本专利技术的有益效果是：
[0019]本专利技术的公开方法中的步骤S2和S3可以减少保藏过程对菌体细胞的破坏，提高保藏菌种的稳定性，菌种保藏的年限可达15年，菌种活化后菌落形态与未保藏菌种一致，恢复后的菌种在活性及发酵性能方面与未保藏生产用菌种基本相同。因此，本专利技术降低了发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs
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4)菌种在产业化生产应用中频繁传代可能导致的菌种变异和退化的风险。
具体实施方式
[0020]本专利技术提供了一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs
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4)菌种长期保藏方法，下面以具体的实施例进一步介绍本专利技术。
[0021]需说明的是，以下实施例中使用的发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs
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4)菌种是从青海新鲜冬虫夏草中分离得到，该菌种于1997年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0327。
[0022]实施例1
[0023]S1：复合冷冻保护剂的制备：按重量体积g/ml计，选取脱脂牛奶、山梨醇两种保护剂，按终浓度配制成25％脱脂牛奶和10％山梨醇溶液，115℃灭菌10分钟，得到冷冻保护剂。
[0024]S2：孢子悬浮液的制备：倒入适量的无菌水于菌种斜面，接种环刮下菌苔上的孢子，倒入含有玻璃珠的灭菌三角摇瓶中，震荡3分钟，倒入有灭菌滤纸的漏斗中过滤，收集滤液，加入适量的无菌水，将孢子悬浮液浓度调整至108个/ml。
[0025]S3：混合与分装：将菌体孢子悬液与复合冷冻保护剂按体积比1:1混合，用无菌毛细滴管吸取0.4ml混合液，滴入安瓿管底部，用无菌棉花封口。
[0026]S4：冷冻干燥：将安瓿管放置于
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20℃环境中，预冻8小时。再将安瓿管放置于冷冻干燥机中，调节冷冻温度为
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40℃，冷冻干燥15小时。
[0027]S5：真空熔封：冷冻干燥后的安瓿管取出，立即插入多歧管的连接硅胶管内，连接并开启高真空泵，达到最大真空后，在继续抽真空下用喷灯对准安瓿管的熔封区熔融封口，用电火花枪检查真空度合格后放入6℃医用冷藏箱保藏。
[0028]实施例2
[0029](1)复合冷冻保护剂制备：按重量体积g/ml计，选取脱脂牛奶、甘露醇两种保护剂，按终浓度配制成30％脱脂牛奶和6％甘露醇溶液，115℃灭菌10分钟，得到冷冻保护剂。
[0030](2)孢子悬浮液制备：倒入适量的无菌水于菌种斜面，接种环刮下菌苔上的孢子，倒入含有玻璃珠的灭菌三角摇瓶中，震荡4分钟，倒入有灭菌滤纸的漏斗中过滤，收集滤液，加入适量的无菌水，将孢子悬浮液浓度调整至109个/ml。
[0031]S3：混合与分装：将菌体孢子悬液与复合冷冻保护剂按体积比1:1混合，用无菌毛细滴管吸取0.4ml混合液，滴入安瓿管底部，用无菌棉花封口。
[0032]S4：冷冻干燥：将安瓿管放置于
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20℃环境中，预冻8小时。再将安瓿管放置于冷冻干燥机中，调节冷冻温度范围为
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50℃，冷冻干燥12小时。
[0033]S5：真空熔封：冷冻干燥后的安瓿管取出，立即插入多歧管的连接硅胶管内，连接并开启高真空泵，达到最大真空后，在继续抽真空下用喷灯对准安瓿管的熔封区熔融封口，用电火花枪检查真空度合格后放入6℃医用冷藏箱保藏。
[0034]实施例3
[0035]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs
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4菌种的长期保藏方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：配制复合冷冻保护剂，灭菌后备用；S2：制备菌体孢子悬浮液，并将菌体孢子悬浮液与步骤S1中的复合冷冻保护剂混合，分装入灭菌后的安瓿管中，封口；S3：将步骤S2的安瓿管预冻，预冻后，将安瓿管进行冷冻干燥；S4：将步骤S3的安瓿管装入多歧管，抽真空后，用火焰熔封，得到待保藏样品；S5：将步骤S4的待保藏样品放置于低温环境中长期保藏。2.根据权利要求1所述的一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs
‑
4菌种的长期保藏方法，其特征在于，所述步骤S1中，复合冷冻保护剂为脱脂牛奶、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、甘油中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs
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4菌种的长期保藏方法，其特征在于，所述步骤S2中，菌体孢子悬浮液的浓度为108～10
10
个/ml。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾乐，杨明，赵鹏，龚永佳，
申请(专利权)人：江西国药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：