一种靶向血管紧张素II1型受体细胞外第二环的抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，为了实现大规模量产理化性质高度均一的AT1

【技术实现步骤摘要】
一种靶向血管紧张素II 1型受体细胞外第二环的抗体及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种靶向血管紧张素II1型受体细胞外第二环的抗体及其应用。

技术介绍

[0002]目前，心血管疾病仍是全球最主要死亡原因，肾素
‑
血管紧张素
‑
醛固酮系统(renin
‑
angiotensin
‑
aldosterone system, RAAS) 对心血管系统维持稳定、正常发育，以及血压调节等均有重要作用。RAAS的主要效应物是血管紧张素 II（angiotensin II，Ang II），Ang II通过激活血管紧张素II 1型受体（Angiotensin II type 1 receptor，AT1R）信号传导发挥各种生理和病理生理作用。
[0003]AT1R是典型的GPCR七次跨膜α
‑
螺旋结构，具有一个细胞外N端、三个细胞外环(ECL1
‑
3)、三个细胞内环(ICL1
‑
3)、一个两亲性螺旋VIII（H8）和一个细胞内C末端，其中ECL2免疫原性最强。AT1R的过度活化可导致脉管系统功能障碍，如血管张力增加、炎症、纤维化和血栓形成等。在病理生理条件下，Ang II会慢性激活AT1R，导致受体过度激活，随后会引发高血压、心力衰竭、血管重塑、糖尿病肾病和动脉粥样硬化等多种疾病。但是在部分心血管疾病中发现，AT1R过度活化，Ang II水平却并不高，这提示可能存在其他因素参与其中。
[0004]20世纪末，研究者陆续在子痫前期、冠心病、高血压、外周动脉病等多种心血管疾病患者血清中，发现存在一种针对AT1R的自身抗体（angiotensin II type 1 receptor autoantibody，AT1
‑
AA）。该自身抗体可以发挥类Ang II的受体激动剂样效应。越来越多的研究证实，尽管均可以激活AT1R，但Ang II与AT1
‑
AA结合AT1R的位点及激活受体的模式均有差异。Ang II结合于AT1R的第5、6跨膜区，引起AT1R一过性激活；而AT1
‑
AA可以特异性识别AT1R的细胞外第二环（AT1R
‑
ECL2），导致AT1R及下游信号持续激活，引发内皮损伤、血管平滑肌细胞转型、心肌肥厚等病理效应。因此目前认为AT1
‑
AA是导致多种心血管疾病中AT1R过度活化的重要原因。但是AT1
‑
AA参与心血管疾病的分子调控机制尚未完全阐明，给针对性干预带来困难。
[0005]获得足够量且高纯度的AT1
‑
AA是研究其病理意义和具体分子机制的首要前提。目前获取AT1
‑
AA的方式主要有两种：一是从临床患者血清中提纯出AT1
‑
AA。但是临床患者血清来源有限、滴度低、采集困难，若提纯不及时可造成AT1
‑
AA滴度下降或损失，故难以为AT1
‑
AA的机制研究提供充足保障；二是通过主动免疫获得AT1
‑
AA，即复制免疫反应，但是主动免疫耗时较长，且抗体是多克隆的，难以开展精细的分子调控机制研究。因此，获得具有高效力和特异性且成本相对较低的AT1
‑
AA是限制本领域发展的重要瓶颈问题。为此，我们利用人的AT1R
‑
ECL2肽段制备了可产生单克隆抗体AT1
‑
AA的杂交瘤细胞。尽管杂交瘤细胞可以生产高纯度的单克隆AT1
‑
AA，但提纯成本较高，限制了其应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术为了实现大规模量产理化性质高度均一的AT1
‑
AA，提供了一种靶向血管紧张素II1型受体细胞外第二环的抗体及其应用。通过提取杂交瘤细胞的RNA，逆转录cDNA后，PCR扩增抗体基因，确定抗体重链、轻链氨基酸序列及CDR区。通过上述方法原创性获得AT1
‑
AA的氨基酸序列，从而为后期采用重组蛋白表达的方法制备批量生产低成本的单克隆AT1
‑
AA提供了必要的基础工作。
[0007]本专利技术由如下技术方案实现的：一种靶向血管紧张素II1型受体细胞外第二环的抗体，所述抗体可变区基因为336bp；其重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；重链氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0008]制备所述靶向血管紧张素II1型受体细胞外第二环的抗体的方法，提取杂交瘤细胞的RNA，逆转录cDNA后，PCR扩增抗体基因，确定抗体重链、轻链氨基酸序列及CDR区；获得靶向血管紧张素II1型受体细胞外第二环的抗体AT1
‑
AA的氨基酸序列。
[0009]具体方法为：（1）杂交瘤细胞的获得：用血管紧张素II1型受体细胞外第二环 AT1R
‑
ECL2的主动免疫Balb/C小鼠；将小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，产生分泌AT1
‑
AA的单克隆杂交瘤并培养，然后将处于对数期的细胞注入小鼠腹腔取腹水。用1
×
107注射后从小鼠腹水中分离出高度纯化的AT1
‑
AA杂交瘤。参考文献（《Wei M, Zhao C, Zhang S, Wang L, Liu H, Ma X. Preparation and Biological Activity of the Monoclonal Antibody against the Second Extracellular Loop of the Angiotensin II Type 1 Receptor.》J Immunol Res. 2016;2016:1858252.）所述方法。
[0010]（2）杂交瘤细胞中提取和纯化AT1
‑
AA：利用亲和层析，从杂交瘤细胞中得到AT1
‑
AA，使用Mab Trap
TM Protein G HP 5 mL高效纯化柱（GE Heathcare Life Sciences）进行提取和纯化，获得高纯度的AT1
‑
AA；具体为：将杂交瘤细胞悬液注射到小鼠腹腔内，待小鼠腹部出现膨隆14
‑
18天后，抽取腹水用于提纯。先用结合缓冲液润洗纯化柱，将腹水与结合缓冲液等体积混合后过纯化柱，继续用结合缓冲液洗杂，最后用洗脱缓冲液将结合到柱子上的IgG洗脱下来，用结合缓冲液润洗以复兴纯化柱；利用分离培养的原代乳鼠心肌细胞对获得的AT1
‑
AA进行乳鼠心肌细胞跳动频率的检测，验证所纯化的AT1
‑
AA的生物活性；具体为：将出生0
‑
4天的乳鼠快速断头，取出心脏洗涤血液并去除结缔组织，将心脏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向血管紧张素II1型受体细胞外第二环的抗体，其特征在于：所述抗体可变区基因为336bp；其重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；重链氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。2.制备权利要求1所述靶向血管紧张素II1型受体细胞外第二环的抗体的方法，其特征在于：提取杂交瘤细胞的RNA，逆转录cDNA后，PCR扩增抗体基因，确定抗体重链、轻链氨基酸序列及CDR区；获得靶向血管紧张素II1型受体细胞外第二环的抗体AT1
‑
AA的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：具体方法为：（1）杂交瘤细胞的获得：用血管紧张素II1型受体细胞外第二环AT1R
‑
ECL2主动免疫Balb/C小鼠，将小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，产生分泌AT1
‑
AA的单克隆杂交瘤并培养，然后将1
×
107个处于对数期的杂交瘤细胞导入到小鼠腹腔取腹水；从小鼠腹水中分离出高度纯化的AT1
‑
AA杂交瘤；（2）杂交瘤细胞中提取和纯化AT1
‑
AA：利用亲和层析，从杂交瘤细胞中得到AT1
‑
AA，使用Mab Trap
TM Protein G HP 5 mL高效纯化柱进行提取和纯化，获得高纯度的AT1
‑
AA；具体为：将杂交瘤细胞悬液导入到小鼠腹腔内，待小鼠腹部出现膨隆14
‑
18天后，取腹水用于提纯；先用结合缓冲液润洗纯化柱，将腹水与结合缓冲液等体积混合后过纯化柱，继续用结合缓冲液洗杂，最后用洗脱缓冲液将结合到柱子上的IgG洗脱下来，用结合缓冲液润洗以复兴纯化柱；利用分离培养的原代乳鼠心肌细胞对获得的AT1
‑
AA进行乳鼠心肌细胞跳动频率的检测，验证所纯化的AT1
‑
AA的生物活性；具体为：取出生0
‑
4天的乳鼠心肌组织，加入混合酶液反复消化组织，过滤得到单细胞组悬液后接种在培养皿中，贴壁2小时后收集主要含有心肌细胞的悬液，离心后用新的培养基重悬，贴壁36小时后换液；将正常培养在6孔板中的乳鼠心肌细胞撤去含胎牛血清的培养基，更换为普通的DMEM高糖培养基，24小时后先进行心肌细胞基础跳动频率的计数，之后分别加入浓度为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧荣，张苏丽，张茜，武烨，白丽娜，王鹏丽，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：