内切菊粉酶Inu-B及其在降解菊粉果聚糖生产高活性高纯度益生元菊粉三糖中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种内切菊粉酶Inu

【技术实现步骤摘要】
内切菊粉酶Inu
‑
B及其在降解菊粉果聚糖生产高活性高纯度益生元菊粉三糖中的应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，涉及一种内切菊粉酶Inu
‑
B及其在降解菊粉果聚糖生产高活性高纯度益生元菊粉三糖中的应用，具体涉及一种可降解菊粉果聚糖来源于Paenibacillus sp.LX16菌株中的内切菊粉酶Inu
‑
B 的异源表达方式，并能够通过降解菊粉果聚糖的形式生产高活性高纯度益生元菊粉三糖。

技术介绍

[0002]菊粉(Inulin)是以β
‑
1,2糖苷键连成的多聚果糖，其还原性末端有一个葡萄糖残基以蔗糖型糖苷键连接，呈直链结构，简写式为GFn。菊粉是自然界当中产量仅次于淀粉的植物性多糖，是十分理想的功能性食品配料，同时也是生产低聚果糖、多聚果糖、高果糖浆和结晶果糖等产品的良好原料。
[0003]菊粉酶(inulinase)，又称β
‑
果聚糖酶，是一种糖苷水解酶，催化作用菊粉中的β
‑
2,1
‑
呋喃果糖苷键，主要来源于微生物，在哺乳动物体内缺乏分解菊粉的酶类。根据菊粉酶对底物作用方式的不同，又细分为内切菊粉酶(endoinulinase，EC 3.2.1.7)和外切菊粉酶(exoinulinase，EC 3.2.1.26)。不同类型菊粉酶，对菊粉进行降解后获得不同的产物，其中内切菊粉酶随机作用菊粉链内部的糖苷键，水解产物主要是不同聚合度(DP)的低聚果糖混合物。
[0004]低聚果糖作为一种益生元主要具有使肠道内双歧杆菌增殖，保持良好的肠道环境，调节血糖、血脂，促进人体对矿物元素的吸收，改善肠道健康，增强抵抗力等功能。其优越的生理功能成为近十年来国际食品市场上广泛流行的功能性食品基料，应用范围多达500余种食品、保健品和药品，被誉为二十一世纪健康新糖源。
[0005]菊粉三糖是通过β
‑
2,1键连接三个果糖形成的，分子量最小的低聚果糖，有研究表明，菊粉三糖除具有大部分低聚果糖的功能外，也有其自身的特点，菊粉三糖作为益生元，因其分子量小，使其利用效率要高于长链或是支链的低聚果糖，更有利于被肠道菌群吸收。菊粉三糖在科研领域也有很重要的应用，作为实验室薄层层析，离子色谱，高效液相色谱等分析仪器的标准品，也用于酶学表征过程中的酶反应底物等。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供的内切菊粉酶Inu
‑
B可以使菊粉底物在降解后得到的菊粉三糖纯度高达92.3％。
[0007]为实现使菊粉三糖在产物中的高比例，所述内切菊粉酶Inu
‑
B为：由 SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0008]本专利技术还提供了编码上述内切菊粉酶Inu
‑
B的基因。
[0009]本专利技术的实施方式中所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术还提供了携带上述基因的重组质粒。
[0011]本专利技术在实施方式中，所述重组质粒的载体为pET28a(+)载体。
[0012]本专利技术还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0014]本专利技术还提供了上述内切菊粉酶Inu
‑
B的制备方法，将所述宿主细胞加入到培养基中培养至OD
600
＝0.5～0.6后，在发酵液中添加终浓度为0.1 mM IPTG后，在20℃的条件下继续诱导培养16h，得到内切菊粉酶Inu
‑
B。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基包含LB培养基
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述培养的温度为20℃、转速为200 rpm。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述IPTG在发酵液中的浓度为0.1mM。
[0018]本专利技术还提供了应用上述方法制备得到的内切菊粉酶。
[0019]本专利技术还提供了上述内切菊粉酶Inu
‑
B或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述制备方法或应用上述制备方法得到的内切菊粉酶在降解菊粉果聚糖并生产高活性高纯度益生元菊粉三糖方面的应用。
[0020]本专利技术还提供了一种降解菊粉果聚糖并生产高活性高纯度益生元菊粉三糖的方法，将上述内切菊粉酶Inu
‑
B加入到含有菊粉的缓冲液中进行转化，得到高活性高纯度益生元菊粉三糖。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50mM。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0
‑
8.0，进一步地，pH为7.0。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述转化的温度为25
‑
35℃，进一步地，
[0025]温度为30℃。
[0026]本专利技术进一步对产物进行了分析鉴定。
[0027]本专利技术的有益效果为本专利技术利用内切菊粉酶Inu
‑
B将菊粉降解为高活性高纯度益生元菊粉三糖，所述菊粉三糖的纯度高达92.3％，克服了酶解法生成菊粉三糖产量低的缺点，降低简化了分离纯化的操作难度，为菊粉三糖的工业化生产提供了更加便捷的方案。
附图说明
[0028]图1是本专利技术的内切菊粉酶Inu
‑
B纯化后的SDS
‑
PAGE电泳图；其中，泳道1为pET28a(+)空载；泳道2为IPTG诱导的粗酶液；泳道3为经过Ni
‑
NTA纯化的蛋白。
[0029]图2是本专利技术的内切菊粉酶Inu
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B降解菊粉果聚糖生成菊粉三糖的离子色谱图。
[0030]图3是本专利技术的利用Inu
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B降解菊粉果聚糖主产物的二级质谱图及与菊粉三糖标品质谱对照图。
[0031]图4是本专利技术的内切菊粉酶Inu
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B最适反应温度及温度稳定区间；其中，a为Inu
‑
B酶活最适反应温度；b为Inu
‑
B酶活温度稳定区间。
具体实施方式
[0032]下述非限定性实施例子可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。
[0033]实施例1
[0034]本实施例子中所述的内切菊粉酶Inu
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B基因的克隆、表达及纯化方法如下：
[0035]A、菊粉果聚糖降解菌Paenibacillus sp.LX16作为内切菊粉酶Inu
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B 来源菌，来自于本实验前期筛选；
[0036]如上所述的菊粉果聚糖降解菌Paenibacillus sp.LX16是本实验室从土壤中分离获得并保存于中国典型培养物保藏中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内切菊粉酶Inu
‑
B，其特征在于，所述内切菊粉酶Inu
‑
B为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。2.编码权利要求1所述内切菊粉酶Inu
‑
B的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET28a(+)载体。5.携带权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组质粒的宿主细胞。6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。7.权利要求1所述内切菊粉酶Inu
‑
B的制备方法，其特征在于，将权利要求5或6所述宿主细胞加入到培养基中培养至OD
600
＝0.5～0.6后，在发酵液中添加IPTG在2...

【专利技术属性】
技术研发人员：高子晴，王鑫，李双岐，杨帆，李宪臻，
申请(专利权)人：李宪臻，
类型：发明
国别省市：