C2H2型锌指蛋白基因HSTL在调控水稻耐盐性中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，尤其涉及C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用。C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用；所述C2H2型锌指蛋白基因HSTL的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；其编码转录因子HSTL的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术构建了hstl单突变体和hstl/hst双突变体，并通过鉴定突变体在提高水稻耐盐性方面所发挥的功能，探究对水稻盐胁迫应答的调控机制，这对培育新的高耐盐性水稻品种具有重要的意义。种具有重要的意义。种具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
C2H2型锌指蛋白基因HSTL在调控水稻耐盐性中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，尤其涉及C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子 HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用。

技术介绍

[0002]高盐度是农业中最严重的非生物胁迫之一。研究人员已经分离克隆了不同植物的盐诱导基因。ABA在植物的渗透胁迫反应中起关键作用。在盐胁迫下，植物启动ABA信号转导途径以激活防御相关基因的表达，其中C2H2锌指蛋白发挥重要作用。盐胁迫导致活性氧的积累，这对植物细胞是有毒的。C2H2锌指蛋白可调节与ROS清除有关的基因的表达，以减少盐胁迫下H2O2的积累。据报道，从水稻中分离的ZFP179含有两个典型的C2H2锌指结构域和位于其C
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末端的DLN
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box/EAR
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基序，并且在功能上是一种新的盐响应基因。ZFP179过量表达的转基因水稻显示出耐盐性增强。当水稻遭受盐胁迫时，ZFP179可通过三种机制增加植物耐盐性：ABA依赖途径，ABA非依赖途径和ROS清除系统。在ZFP179过表达转基因水稻植株中，ABA依赖性途径中δ1
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吡咯啉
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羧酸合成酶(Delta1
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pyrroline
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carboxylatesynthetase，OsP5CS)和脯氨酸转运(Proline transport，OsProT)基因的表达上调，因此脯氨酸含量增加。在ABA非依赖途径中，OsDREBA2A(Dehydration
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responsive element binding 2A) 基因的表达增强，导致耐盐性提高。此外，ZFP179可以增加植物细胞的ROS清除活性，从而减少高盐胁迫下的氧化应激。另一种水稻C2H2锌指蛋白基因ZFP182编码具有核定位信号的蛋白质和富含亮氨酸的结构域，然而没有DLN
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box/EAR
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基序。ZFP182在成熟水稻植物的叶，茎，根和穗中组成性表达。对其转录水平和启动子的分析显示ZFP182由盐和ABA诱导，表明ZFP182可能通过ABA依赖途径在耐盐性中起重要作用。
[0003]Ma等在小麦中克隆了新的基因TaZNF(Triticum aestivum predicted Dof zinc fingerprotein)。TaZNF属于C2H2锌指转录因子家族。TaZNF的过表达提高了拟南芥的耐盐性。在盐胁迫下，转基因植物积累了大量的脯氨酸和叶绿素。此外，转基因植物通过减少气孔张开来保持较高的含水量以保护植物免受盐胁迫。这些结果表明，TaZNF确实与植物的耐盐性有关。
[0004]研究者已报道了在盐胁迫下其他C2H2锌指蛋白，包括编码STZ和3种拟南芥锌指蛋白的表达分析。在高盐胁迫下，4个锌指蛋白基因AZF1、AZF2、AZF3和STZ的表达水平均有所提高，但AZF2的表达水平未提高。在这四种锌指蛋白中，只有ABA处理强烈诱导AZF2 表达，其诱导动力学与高盐度引起的诱导相似。Guo等利用生物信息学方法和RT
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PCR从水稻幼苗中分离到两个C2H2锌指蛋白基因RZF5和RZF71。表达分析表明，在水稻幼苗中用150 mM NaCl和20％聚乙二醇(PEG)6000处理显著增强了RZF5和RZF71的表达，而ABA处理对这些基因的表达几乎没有影响。RZF5和RZF71的过表达显著提高了转基因植物的抗盐性。
[0005]目前，全球土地盐碱化问题日趋严重，成为限制农业生产发展的主要障碍因素。水稻在长期进化中逐渐形成了多种响应盐胁迫的生理调控保护机制。C2H2型锌指蛋白基因最早在非洲爪蟾中发现，植物中发现的第一个C2H2型锌指蛋白基因是在矮牵牛中分离得到的
ZPT2
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1，之后陆续在拟南芥、棉花、大豆、水稻等植物中分离到了该类型的锌指蛋白。研究发现，C2H2 型转录因子是锌指结构转录因子家族的主要成员之一，主要参与植物生长、发育以及对多种非生物胁迫的应答，如低温胁迫、盐胁迫、光照胁迫和干旱胁迫等方面。本研究组前期获得了一个水稻耐高温突变体hst，其突变基因为C2H2型锌指蛋白中的HST转录因子。在此基础上，发现了与HST具有相同锌指结构域的同源物HSTL。

技术实现思路

[0006]为了解析水稻响应盐胁迫响的分子生理机制，为培育高耐盐性的水稻品种提供基础，本专利技术提供了C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用。本申请利用CRISPR/Cas9技术构建了hstl单突变体和hstl/hst 双突变体，并通过鉴定突变体在提高水稻耐盐性方面所发挥的功能，探究对水稻盐胁迫应答的调控机制，这对培育新的高耐盐性水稻品种具有重要的意义。
[0007]为了实现上述的专利技术目的，本专利技术采用了以下的技术方案：
[0008]C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用；所述C2H2型锌指蛋白基因HSTL的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；其编码转录因子HSTL的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
[0009]作为优选，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过负调控作用影响水稻耐盐性。
[0010]作为优选，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过调控抗氧化酶活性影响水稻的耐盐性；优选，抗氧化酶为POD、SOD和CAT。
[0011]作为优选，所述高耐盐性水稻品种为通过CRISPR/Cas9技术，在HSTL基因内选取靶位点将该基因敲除所获得的水稻突变体；作为优选，所述的水稻突变体为hstl单突变体或hstl/hst 双突变体；最优选hstl单突变体为hstl 3
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1和hstl 12
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1，hstl/hst双突变体为hstl/hst 15
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2和 hstl/hst 3
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2。
[0012]进一步，本申请提供了一种基因敲除载体，为C2H2型锌指蛋白基因HSTL的CRISPR/Cas9 基因敲除载体，包含SEQ ID NO：3
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6所示的核苷酸序列。
[0013]进一步，本申请提供了一种重组菌和/或转基因细胞系，包含所述的基因敲除载体。
[0014]进一步，本申请提供了所述的基因敲除载体、重组菌和/或转基因细胞系在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用。
[0015]进一步，本申请提供了所述高耐盐性水稻品种的培育方法，包括以下步骤：通过 CRISPR/Cas9技术，设计特异性靶向HSTL基因编码序列的sgRNA，构建得到基因敲除载体，将其转化入水稻，对获得的植株进行鉴定以获得水稻突变体。
[0016]作为优选，所述sgRNA表达框的引物序列如SEQIDNO：7...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻耐盐性和培育高耐盐性水稻品种中的应用；所述C2H2型锌指蛋白基因HSTL的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码转录因子HSTL的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过负调控作用影响水稻的耐盐性。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过调控抗氧化酶活性影响水稻的耐盐性；优选，抗氧化酶为POD、SOD和CAT。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高耐盐性水稻品种为通过CRISPR/Cas9技术，在HSTL基因内选取靶位点将该基因敲除所获得的水稻突变体；作为优选，所述的水稻突变体为hstl单突变体或hstl/hst双突变体；最优选hstl单突变体为hstl 3
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1和hstl 12
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1，hstl/hst双突变体为hstl/hst 15
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2和h...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁艳菲，周媚，邵佳慧，朱诚，王飞娟，贺希格都楞，江琼，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：