一种用于肠道菌群移植的粪菌制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于肠道菌群移植的粪菌制备方法。包括：(1)肠道菌群网状载体制备；(2)肠道菌群悬浮液的制备；(3)仿生肠道的制备；(4)肠道菌群的体外连续培养；(5)肠道菌群培养后的收集。本发明专利技术提供的用于肠道菌群移植的粪菌制备方法通过模拟人体肠道中菌群的生活环境实现了肠道菌群的体外培养，保证了菌群品质和产量的稳定，解除了肠道菌群移植治疗的时间限制，极大地提升了临床应用的时效性。本发明专利技术制备的肠道菌群产量大，活性高。且本发明专利技术的肠道菌群在缓解炎性肠病患者体重下降、缓解炎性肠病患者食物利用系数下降、缓解炎性肠病患者红细胞数量下降、降低炎性肠病患者白细胞数量和提高肠道有益菌含量方面均有明显提升。和提高肠道有益菌含量方面均有明显提升。

【技术实现步骤摘要】
一种用于肠道菌群移植的粪菌制备方法


[0001]本专利技术涉及一种用于肠道菌群移植的粪菌制备方法，属于肠道菌群移植


技术介绍

[0002]肠道菌群移植也称为粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)，是一种从健康捐赠者的粪便中分离功能菌群，将其移植至患者消化道，从而重建患者肠道菌群的微生态治疗方法，目前该方法已被用于多种胃肠道和代谢性疾病的治疗，如慢性功能性便秘、难治性艰难梭菌感染、炎性肠病等。
[0003]追溯FMT的起源，最早用于治疗人类疾病的文字记载是中国东晋时期(公元300
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400年)葛洪所著的《肘后备急方》(也称《肘后方》)，文中描述用人粪治疗食物中毒、腹泻、发热并濒临死亡的患者，“饮之，即活”。中国明代李时珍所著的《本草纲目》(1596年版)记载了多达二十多种用人粪治病的疗方。近代关于FMT的文献报道可以追溯到1958年，美国科罗拉多大学医学院外科医生BenEiseman及其同事，利用健康人的大便制成粪水对4例常规抗生素、激素治疗无效的严重伪膜性肠炎患者实施灌肠。结果成功治愈其中3例垂危患者，另1例患者死于与肠道感染无关的其他疾病。
[0004]2013年，首项FMT治疗复发性难辨梭状芽孢杆菌性肠炎的临床对照研究证明FMT的疗效显著优于万古霉素。FMT在动物实验和临床试验中均显示出其他治疗方法无法比拟的优越性。《Science》和《TIME》将其评为2013年生物医学的十大突破之一。
[0005]目前临床开展的肠道菌群移植治疗皆为取供体新鲜粪便制备标准菌液进行治疗。这种新鲜粪菌标准液需要将从粪便采集到治疗过程的时间控制在6h以内，时间紧迫，并且合格供体不易寻找，供体筛选费用较高，这些问题都阻碍了肠道菌群移植的临床应用，因此寻求快捷、高活性的用于肠道菌群移植的粪菌的制备方法尤为重要。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种用于肠道菌群移植的粪菌制备方法。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种用于肠道菌群移植的粪菌制备方法，包括如下步骤：
[0009](1)肠道菌群网状载体制备：将植物纤维编织成网状结构，再将网状结构搭建成圆柱状纤维网，接着将圆柱状纤维网在浓度为2～5％的粘蛋白溶液中摇床浸泡15～20min，摇床转速为10～20rpm，得到肠道菌群网状载体；
[0010](2)肠道菌群悬浮液的制备：收集正常健康供体粪便，然后将粪便稀释于生理盐水中，使用均浆机进行摇匀，完成后使用医疗纱布进行过滤，得到肠道菌群悬浮液；
[0011](3)仿生肠道的制备：根据医学消化科精准人体肠道解剖模型，制作管状人体肠道模具，然后将透明硅胶注入模具中，固化成型后取出，得到仿生肠道；
[0012](4)肠道菌群的体外连续培养：
[0013]将步骤(1)制备的肠道菌群网状载体置于仿生肠道末端，将步骤(2)制备的肠道菌群悬浮液接种至步骤(3)制备的仿生肠道中，然后依次加入无菌水、营养剂、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶后进行厌氧培养1～4周，每8h重复添加一次无菌水、营养剂、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶，每24h排出一次无菌水、营养剂、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶；
[0014](5)肠道菌群培养后的收集：
[0015]取出肠道菌群网状载体，在生理盐水中摇床浸泡4～6次，每次浸泡时间为2～6min，摇床转速为2～10rpm，浸泡后厌氧环境保存，得到用于肠道菌群移植的粪菌。
[0016]根据本专利技术优选的，步骤(1)中，所述植物纤维为水果、蔬菜、豆类、坚果、谷物和菌菇的植物纤维。
[0017]根据本专利技术优选的，步骤(1)中，所述网状结构的各边线长度一致，为0.1～1cm。
[0018]根据本专利技术优选的，步骤(1)中，所述圆柱状纤维网直径为50～100μm，总长度为1.2～1.5m。此圆柱状纤维网形态与后续制备的仿生肠道一致。
[0019]根据本专利技术优选的，步骤(2)中，所述粪便和生理盐水的质量体积比为1：(3～30)，单位为g/mL。
[0020]根据本专利技术优选的，步骤(3)中，所述管状人体肠道模具由芯模和套管构成内部空腔，透明硅胶注入该内部空腔中。
[0021]根据本专利技术优选的，步骤(3)中，所述仿生肠道的厚度为1～4mm，长度为9～10m，前4～6m的直径为1～2cm，其余直径为2～3cm。
[0022]根据本专利技术优选的，步骤(4)中，所述肠道菌群悬浮液和无菌水的体积比为1：(0.5～1)。
[0023]根据本专利技术优选的，步骤(4)中，所述营养剂由以下质量份数的原料组成：
[0024]水解乳清蛋白2～9份，浓缩乳清蛋白2～10份，大豆分离蛋白2～7份，其他蛋白2～7份，氨基酸预混料1.35～11.5份，核苷酸预混料1～5份，麦芽糊精30～53份，低聚果糖1～5份，低聚半乳糖1～5份，聚葡萄糖1～4份，植物油粉末7～20份，矿物质预混料4～18份，维生素预混料0.23～6.75份；
[0025]所述的水解乳清蛋白、浓缩乳清蛋白为无乳糖型乳清蛋白；
[0026]所述其他蛋白为黑豆蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白、豌豆蛋白、胶原蛋白、白蛋白或海参蛋白；
[0027]所述氨基酸预混料以1g计包括：L
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谷氨酰胺50～75mg、苏氨酸53～72mg、丝氨酸65～87mg、脯氨酸20～41mg、半胱氨酸2～10mg、牛磺酸0.001～0.006mg，余量为麦芽糊精；
[0028]所述核苷酸预混料以1g计包括：核苷酸15～35mg，余量为麦芽糊精；所述的核苷酸为5'
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单磷酸胞苷(5'
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CMP)、5'
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单磷酸尿苷(5'
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UMP)、5'
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单磷酸腺苷(5'
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AMP)、5'
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肌苷酸二钠、5'
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鸟苷酸二钠、5'
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尿苷酸二钠或5'
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胞苷酸二钠中的一种或两种以上的混合物；
[0029]所述矿物质预混料以1g计包括：一水柠檬酸钠128～176mg、氯化钾88～128mg、葡萄糖酸铜0.1～0.8mg、葡萄糖酸镁152～168mg、富马酸亚铁1.5～4mg、葡萄糖酸锌2～6mg、葡萄糖酸锰0.5～3mg、磷酸氢钙97～135mg、碘化钾0.004～0.009mg、亚硒酸钠0.002～0.009mg，氯化铬50～80μg、钼酸铵70～100μg、氟化钾0.3～0.7mg，余量为麦芽糊精；
[0030]所述维生素预混料以1g计包括：维生素A醋酸酯油0.1～1.5IU、维生素D3 0.01～
0.1IU、维生素E醋酸酯0.1～1mg、维生素K1 0.01～0.1mg、盐酸硫胺素(B1)0.008～0.15mg、核黄素(B2)0.007～0.12mg、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肠道菌群移植的粪菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)肠道菌群网状载体制备：将植物纤维编织成网状结构，再将网状结构搭建成圆柱状纤维网，接着将圆柱状纤维网在浓度为2～5％的粘蛋白溶液中摇床浸泡15～20min，摇床转速为10～20rpm，得到肠道菌群网状载体；(2)肠道菌群悬浮液的制备：收集正常健康供体粪便，然后将粪便稀释于生理盐水中，使用均浆机进行摇匀，完成后使用医疗纱布进行过滤，得到肠道菌群悬浮液；(3)仿生肠道的制备：根据医学消化科精准人体肠道解剖模型，制作管状人体肠道模具，然后将透明硅胶注入模具中，固化成型后取出，得到仿生肠道；(4)肠道菌群的体外连续培养：将步骤(1)制备的肠道菌群网状载体置于仿生肠道末端，将步骤(2)制备的肠道菌群悬浮液接种至步骤(3)制备的仿生肠道中，然后依次加入无菌水、营养剂、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶后进行厌氧培养1～4周，每8h重复添加一次无菌水、营养剂、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶，每24h排出一次无菌水、营养剂、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶；(5)肠道菌群培养后的收集：取出肠道菌群网状载体，在生理盐水中摇床浸泡4～6次，每次浸泡时间为2～6min，摇床转速为2～10rpm，浸泡后厌氧环境保存，得到用于肠道菌群移植的粪菌。2.如权利要求1所述的肠道菌群移植的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述植物纤维为水果、蔬菜、豆类、坚果、谷物和菌菇的植物纤维；所述网状结构的各边线长度一致，为0.1～1cm。3.如权利要求1所述的肠道菌群移植的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述圆柱状纤维网直径为50～100μm，总长度为1.2～1.5m。4.如权利要求1所述的肠道菌群移植的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述粪便和生理盐水的质量体积比为1：(3～30)，单位为g/mL。5.如权利要求1所述的肠道菌群移植的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述管状人体肠道模具由芯模和套管构成内部空腔，透明硅胶注入该内部空腔中；所述仿生肠道的厚度为1～4mm，长度为9～10m，前4～6m的直径为1～2cm，其余直径为2～3cm。6.如权利要求1所述的肠道菌群移植的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述肠道菌群悬浮液和无菌水的体积比为1：(0.5～1)。7.如权利要求1所述的肠道菌群移植的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述营养剂由以下质量份数的原料组成：水解乳清蛋白2～9份，浓缩乳清蛋白2～10份，大豆分离蛋白2～7份，其他蛋白2～7份，氨基酸预混料1.35～11.5份，核苷酸预混料1～5份，麦芽糊精30～53份，低聚果糖1～5份，低聚半乳糖1～5份，聚葡萄糖1～4份，植物油粉末7～20份，矿物质预混料4～18份，维生素预混料0.23～6.75份；所述的水解乳清蛋白、浓缩乳清蛋白为无乳糖型乳清蛋白；所述其他蛋白为黑豆蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白、豌豆蛋白、胶原蛋白、白蛋白或海参蛋白；所述氨基酸预混料以1g计包括：L
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【专利技术属性】
技术研发人员：汪运山，丁兴龙，朱成龙，高丽鹤，
申请(专利权)人：山东省大健康精准医疗产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：