一种一步法核酸检测方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种一步法核酸检测方法及其应用。本发明专利技术在在同一个空间内，将用于DNA恒温扩增RAA的反应体系、用于基因编辑CRISPR/Cas12b荧光信号检测体系同时加入，不需要额外的扩增产物转移的步骤，即可实现核酸检测，实际操作简单快捷，杜绝气溶胶污染。本发明专利技术提供的核酸检测方法，可以将样品到核酸结果判读的整个过程缩减到30min以内，并且这个系统无需进行核酸提取，灵敏度达到0.2copies/μL，具有极高的灵敏度，可以用于百日咳杆菌核酸的检测，有助于降低感染率与疾病的传播率。病的传播率。病的传播率。

【技术实现步骤摘要】
一种一步法核酸检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种一步法核酸检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]病毒或细菌引起的呼吸道感染是全世界人类最常见的疾病之一，识别呼吸道病毒感染的病原体对于选择合适的治疗方法和预防流行病具有重要意义。因此研制快速、准确诊断病原体的试剂，对疾病监测、药物指导和治疗评价有深刻影响。
[0003]百日咳，是由百日咳杆菌引起的急性呼吸道感染，早期诊断对治疗百日咳至关重要。目前，实验室常用的百日咳诊断方法包括培养、直接荧光抗体检测、PCR、配对和单一血清学技术（A. M. Wendelboe and A. Van Rie, Expert review of molecular diagnostics, 2006, 6, 857
‑
864.）。通过培养分离百日咳杆菌是诊断百日咳的传统“金标准”。它的特异性约为100%。然而，培养的灵敏度很低，从12%到60%不等，而且培养需要很长时间，平均需要5天到10天。传统的聚合酶链反应（PCR）或逆转录聚合酶链式反应（RT
‑
PCR）方法是核酸检测的金标准，灵敏度高。自20世纪90年代以来，PCR已被用作临床百日咳杆菌的诊断工具，并在研究环境中广泛使用。然而，PCR技术需要熟练的操作人员和完善的设备基础设施，样本检测时间长，这不适合简单快速的床旁检测（POCT）。
[0004]近年来，基于规则簇状间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白（CRISPR/Cas）的核酸检测方法已成为床旁检测（POCT）的热点。RNA引导的CRISPR/Cas系统蛋白在识别目标核酸时，它们不仅顺式切割（cis
‑
cleavage）靶核酸，而且可以非特异地反式切割（trans
‑
cleavage）旁侧的单链非靶核酸。利用这一特性，CRISPR/Cas核酸酶蛋白与等温扩增技术相结合，如重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导等温扩增（LAMP），研究者开发了一系列灵敏、快速和可视化的核酸检测方法，这些方法不需要特殊的精密仪器。例如，基于Cas13a或Cas13b的特异性高灵敏度的SHERLOCK；基于Cas12a的DNA内切酶靶向CRISPR的DETECTR和基于Cas12b的Cas12b介导的DNA检测CDetection。然而，这些方法需要两步过程，先扩增目标核酸序列，然后进行CRISPR检测。这样的多个处理步骤增加了操作时间，交叉污染和产生气溶胶的风险。

技术实现思路

[0005]针对上述技术难题，本专利技术提供了一种一步法核酸检测方法，本专利技术提供的核酸检测方法，可以在同一空间中将两个反应体系同时加入，不需要额外的扩增产物转移的步骤，实际操作简单快捷，杜绝气溶胶污染，避免了交叉污染。
[0006]为了达到上述技术效果，本专利技术采用的技术方案为：一种一步法核酸检测方法，包括以下步骤：S1、将目标检测样品与释放剂混合震荡，获得混合物I；S2、在PCR反应管中同时加入含有针对靶序列设计的特异引物的DNA恒温扩增体系RAA，含有针对靶序列设计的特异sgRNA与荧光报告探针的基因编辑CRISPR/Cas12b体系；
S3、将检测样品与与释放剂的混合物I检测样品加入上述反应体系中，涡旋震荡，短暂离心（用掌上离心机瞬时离心），获得混合物II；S4、将步骤S3获得的混合物II放入PCR仪器中进行反应，同步读取荧光，根据荧光信号进行结果判读，即得。
[0007]优选地，步骤S2所述的PCR反应管还可以是具有读取荧光信号的恒温加热器，恒温核酸扩增仪，或先放入恒温加热器后在LED蓝光或紫外灯下进行终点荧光判读。
[0008]即本专利技术所述的一步法核酸检测具体操作方法，其与反应体系配套的设备不仅限于PCR仪器，还包括具有读取荧光信号的恒温加热器或恒温核酸扩增仪，或放入恒温加热器37℃、30min后在LED蓝光或紫外灯下进行终点荧光判读。
[0009]优选地，步骤S1所述DNA恒温扩增体系RAA还包括分子拥挤试剂、核酸扩增启动剂、反应干粉酶制剂和扩增引物。
[0010]优选地，所述分子拥挤试剂为20000的聚乙二醇（包括但不限于）；所述核酸扩增启动剂为280mM醋酸镁（包括但不限于）。
[0011]优选地，步骤S2所述基因编辑CRISPR/Cas12b体系还包括Cas12b酶，sgRNA，和荧光探针。
[0012]优选地，所述荧光探针上带有荧光基团与淬灭基团。
[0013]优选地所述荧光基团为FAM（包括但不限于）；所述淬灭基团为BHQ1（包括但不限于）；所述荧光探针为FAM
‑
CCCCCC
‑
BHQ1。
[0014]优选地，步骤S4所述反应过程为于30℃
‑
42℃下反应25~35min。
[0015]本专利技术还提供了一种所述的检测方法在制备百日咳杆菌检测试剂盒中的应用。
[0016]本专利技术还提供了一种百日咳杆菌检测试剂盒，包括DNA恒温扩增RAA体系、基因编辑CRISPR/Cas12b荧光信号检测体系、使用说明书。
[0017]在本专利技术中，我们提供了一种一步法核酸检测方法Rcod，在一步中DNA恒温扩增RAA与基因编辑CRISPR/Cas12b荧光信号检测同时进行，不需要额外的扩增产物转移的步骤，实际操作简单快捷，杜绝气溶胶污染。而且，本专利技术提供的一步法核酸检测方法Rcod具有通用性，可以对含目标核酸的细胞、病毒和细菌等实施检测。
[0018]专利技术人首先在25℃
‑
72℃极广的温度范围内分别单独探索CRISPR/Cas12b的反式切割活性（trans
‑
cleavage activity）与顺式切割活性（cis
‑
cleavage activity）。确认了在30℃
‑
68℃温度范围内，CRISPR/Cas12b展现了极强的反式切割活性，而在45℃
‑
60℃温度范围内，CRISPR/Cas12b具有极强的顺式切割活性。进一步的结合DNA恒温扩增RAA最适的反应温度区间30℃
‑
42℃，最终确定了一步法核酸检测最优的反应温度范围为30℃
‑
42℃，在此温度范围内嗜酸脂环杆菌Cas12b（AacCas12b）仍具有较高的反式切割活性，从而可以特异的切割探针，使整个反应体系具有极强的特异性；而其顺式切割活性极弱，从而不会过多切割DNA恒温扩增产物，保证了一步法核酸检测体系的灵敏度。本专利技术提供的核酸检测方法，可以将样品到核酸结果判读的整个过程缩减到30min以内，并且这个系统无需进行核酸提取，灵敏度达到0.2copies/μL。我们检测了221份百日咳博德特菌临床样本，对比PCR检测结果，本专利技术的敏感性和特异性分别为97.96%和99.19%。
[0019]本专利技术所提供的一步法核酸检测方法Rcod，不需要额外的扩增产物转移的步骤，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种一步法核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将目标检测样品与释放剂混合震荡，获得混合物I；S2、在PCR反应管中同时加入含有针对靶序列设计的特异引物的DNA恒温扩增体系RAA，含有针对靶序列设计的特异sgRNA与荧光报告探针的基因编辑CRISPR/Cas12b体系；S3、将检测样品与释放剂的混合物I加入上述反应体系中，涡旋震荡，短暂离心，获得混合物II；S4、将步骤S3获得的混合物II放入反应仪器中进行反应，读取荧光，根据荧光信号进行结果判读，即得。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S4所述的反应仪器为PCR反应管，具有读取荧光信号的恒温加热器，恒温核酸扩增仪中的一种；所述的读取荧光的方式为： 根据PCR反应直接同步读取荧光，或先放入恒温加热器后在LED蓝光或紫外灯下进行终点荧光判读。3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S2所述DNA恒温扩增体系RAA还含有分子拥挤试剂、核酸扩增启动剂、反应干粉酶制剂和扩增引物。4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述分子拥挤试剂为分子量为2000...

【专利技术属性】
技术研发人员：林康凤，李清涵，郭祥举，尤伟鑫，李博安，张睿，
申请(专利权)人：广州胜全生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：