一种用于体细胞重编程为多巴胺神经元的培养基、试剂盒和培养方法技术

本发明专利技术提供了一种用于体细胞重编程为多巴胺神经元的培养基、试剂盒和培养方法，属于细胞技术领域。本发明专利技术相对于现有技术省略多个转录因子的情况下，使用单一miR

【技术实现步骤摘要】
一种用于体细胞重编程为多巴胺神经元的培养基、试剂盒和培养方法


[0001]本专利技术属于细胞
，具体涉及一种用于体细胞重编程为多巴胺神经元的培养基、试剂盒和培养方法。

技术介绍

[0002]帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种以运动和非运动症状为特征的进行性神经退行性疾病，主要病理表现为黑质纹状体中多巴胺能神经元的丧失，其典型临床症状为运动迟缓、肌强直、震颤及一系列自主神经、认知功能障碍等
[1]。
[0003]当前PD的治疗措施包括药物及手术治疗，药物治疗的疗效随疾病进展而消失
[2]。手术深部脑刺激(deep brain stimulation，DBS)是治疗PD的最常见和有效的手术方法，但不能阻止步态/平衡障碍和痴呆的进展
[3]。目前，基于干细胞生物学蓬勃发展，细胞替代疗法应运而生。通过移植细胞来替代受损的多巴胺神经元恢复细胞功能在治疗PD症状方面具有巨大潜力
[4]。目前，研究使用的细胞类型主要有胚胎干细胞、诱导多能干细胞(IPS)及其诱导分化的神经干细胞和多巴胺神经元，以及胚胎来源的神经干细胞。但胚胎干细胞和胚胎来源的神经干细胞存在细胞来源不足、免疫排斥以及伦理学等问题。而诱导多能干细胞IPS来源于患者的皮肤组织或者血液细胞，可以直接分化形成多巴胺神经元，不存在免疫排斥问题，但存在潜在的致瘤风险。
[0004]直接细胞重编程作为一种新技术在再生医学领域具有重要的应用和发展前景，该方法可使一种成熟细胞在所需组织中原位转化为另一种成熟细胞，不需经过神经干细胞(induced neural stem cells，iNSCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)的过程，能够克服iPSCs治疗PD的局限性，为治疗PD提供了新的方向。通过使用转录因子结合慢病毒载体，导入到成纤维细胞中进行直接重编程可制备多巴胺神经元的方法，可以很好的解决IPS的潜在致瘤性，但是外源转录因子的插入可能会引起基因组的不可控的突变，导致对临床应用价值的使用限制。
[0005]2011年，Pfisterer等
[5]通过在慢病毒载体中过表达三种转录因子ASCL1、BRN2和MYT1L与两个基因FOXA2和LMX1A，首次将人胚胎和出生后成纤维细胞直接重编程为功能性多巴胺神经细胞(iDNs)，但效率较低，TH
+
的iDNs只占Tuj1
+
的神经元总数的10％左右。
[0006]miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA，其可作为基因表达的转录后调节因子
[6]。它们在大脑发育方面有着至关重要的作用，例如神经形成、神经元成熟、突触形成、轴突导向和神经元可塑性
[7]。miRNA不改变基因组且不引发致瘤性，其进行细胞重编程时不存在小分子化合物的毒性和外源基因的参与。既往研究证明，miRNA的特异性缺失，导致中脑iDNs进行性丢失
[8]，证明miRNA在中脑iDNs形成、存活和功能中起关键作用。Gregorio等
[9]使用miR
‑
34b/c结合两种转录因子ASCL1、NURR1可将成纤维细胞直接重编程为iDNs，其与人类中脑DA神经元的电生理特性一致，效率为19.5％。结果表明miR
‑
34b/c可调节Wnt1信号通路的表达，促进细胞周期退出并诱导多巴胺(DA)分化，miR
‑
34b/c使转分化
的效率加倍。因此，miRNA与关键转录因子具备联合作用，可增强iDNs体外生成的能力。
[0007]上述几个研究利用不同的转录因子组合通过慢病毒载体转染的方式将成纤维细胞诱导为多巴胺能神经细胞，其缺陷在于可能将转录因子基因整合进基因组上，产生潜在的不确定性突变，另外，上述方法产生的多巴胺神经元的效率较低，耗费时间较长。重编程诱导体系产生的多巴胺神经元的时间和效率有待进一步提升。
[0008]参考文献
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‑
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[0016][8]Kim J,Inoue K,Ishii J,et al.A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons[J].Science,2007,317(584本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于体细胞重编程为多巴胺神经元的培养基，其特征在于，包括诱导培养基；所述诱导培养基包括以下含量组分：丙戊酸0.01～20mM，TGFβR
‑
1/ALK5抑制剂1～50μM，CDK1/cyclinB和GSK
‑
3β抑制剂1～50μM，毛喉素3～50μM，ROCK
‑
I和ROCK
‑
II抑制剂总摩尔浓度3～50μM，重组人音猬因子10～300ng/ml，成纤维生长因子8B10～300ng/ml和碱性成纤维生长因子5～100ng/ml。2.根据权利要求1所述用于体细胞重编程为多巴胺神经元的培养基，其特征在于，所述诱导培养基包括以下含量组分：丙戊酸0.1～1mM，TGFβR
‑
1/ALK5抑制剂2～8μM，CDK1/cyclinB和GSK
‑
3β抑制剂3～9μM，毛喉素5～8μM，ROCK
‑
I和ROCK
‑
II抑制剂总摩尔浓度5～10μM，重组人音猬因子90～110ng/ml，成纤维生长因子8b90～110ng/ml和碱性成纤维生长因子15～25ng/ml。3.根据权利要求1或2所述用于体细胞重编程为多巴胺神经元的培养基，其特征在于，还包括成熟培养基；所述成熟培养基为毛喉素1～50μMμM，CDK1/cyclinB和GSK
‑
3β抑制剂1～50μM，维生素C0.1～30mM，重组人音猬因子10～300ng/ml，成纤维生长因子8b10～300ng/ml，碱性成纤维生长因子5～300ng/ml和脑源性神经营养因子5～100ng/ml。4.根据权利要求3所述用于体细胞重编程为多巴胺神经元的培养基，其特征在于，所述成熟培养基为毛喉素5μM，CDK1/cyclinB和GSK
‑
3β抑制剂1μM，维生素C2mM，重组人音猬因子100ng/ml，成纤维生长因子8b100ng/ml，碱性成纤维生长因子20ng/ml和脑源性神经营养因子10ng/ml。5.一种用于体细胞重编程为多巴胺神经元的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任意一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃嗣，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：