一种基于MALDI-TOF-MS体外筛选hMAT2A蛋白抑制剂的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于MALDI

【技术实现步骤摘要】
一种基于MALDI
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TOF
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MS体外筛选hMAT2A蛋白抑制剂的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及稳定同位素标记新药物发现
，具体涉及一种基于MALDI
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TOF
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MS体外筛选hMAT2A蛋白抑制剂的方法及其应用。

技术介绍

[0002]蛋氨酸腺苷转移酶2A(Methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A)是蛋氨酸循环中的一种限速酶，主要催化蛋氨酸和三磷酸腺苷(ATP)合成S
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腺苷蛋氨酸(SAM)。人MAT在细胞中以异四聚体的形式存在，由形成催化单位的hMAT2A同源二聚体和两个调节亚基(hMAT2β)组成。MAT2A以其纯化的活性形式形成功能同源二聚体，并与调节蛋白MAT2B结合。MAT2B增加了MAT2A对SAM产物抑制的敏感性从而调节MAT2A的活性，但不能显著增强其活性。MAT2A在人类细胞类型中普遍表达，是人类肿瘤中的主要形式。根据细胞定位研究，MAT2A在胞浆和细胞核中都存在。MAT2A的核浓缩发生在复制和随后的G2期，满足了DNA和组蛋白甲基化过程在S期细胞核内的高度甲基化要求。
[0003]SAM是核酸、磷脂、组蛋白、生物胺和蛋白质甲基化中合成多胺和谷胱甘肽的主要甲基供体，甲基化是蛋白质和核酸的一种重要修饰，甲基化可以控制DNA转录(通过直接DNA甲基化和间接通过组蛋白甲基化)、RNA稳定性和定位，以及蛋白质活性、结构、定位，和蛋白质/蛋白质相互作用。内源性代谢产物和外源性药物也发生甲基化，改变其理化性质和生物活性。甲基化与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关。所以SAM生物合成的调控可影响细胞生长、分化和功能。目前，SAM在转甲基化反应中的活性已被确认为肺癌干细胞发展的限速因子，这同样使MAT2A和蛋氨酸循环的相关酶成为抗癌药物的靶点。
[0004]MAT2A蛋白在结肠癌、肝癌、胃癌、血液和肝脏等癌症中表达增加。大约15％的人类癌症显示MTAP(S
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甲基
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硫代腺苷磷酸化酶)基因缺失，所以缺乏多胺合成的蛋氨酸回收途径。MTAP在chr9p21中的缺失通常包括CDKN2a抑癌基因位点的缺失。MATP
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/
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癌细胞的综合遗传致死性，研究表明，这些癌细胞对MAT2A、PRMT5和PRMT1的抑制增加了敏感性。这一发现导致了寻找针对这些酶的有效药物的研究，目前，针对MAT2A的2种药物已经进入临床试验，一种是针对淋巴瘤和实体瘤的AG
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2703，一种是针对实体瘤的IDE
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397，这为MAT2A作为靶点治疗各种癌症提供了希望和动力，但也说明MAT2A抑制剂仍然是一个缺口，所以，寻找一个高通量的MAT2A抑制剂的筛选方法具有重要的意义。
[0005]目前，体外筛选MAT2A抑制剂的方法主要是通过检测SAM的酶催化化学反应，使用磷酸盐测定试剂盒对反应产生的磷酸盐进行间接测定，从而评价药物对MAT2A抑制活性。例如，在磷酸盐含量测定中，通过与磷酸钾缓冲液(pH 8.028)的标准曲线比较，测定绝对产物量，该方法存在一定的局限性，如费用过高、时间长、操作步骤繁琐等。
[0006]目前，稳定同位素化学标记方法已广泛应用于生物和临床应用的基于高通量质谱(MS)的定量蛋白质组学，它具有消除系统误差、安全、无辐射及定量分析等优点。同时，基质辅助激光诱导解析电离质谱(MALDI
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TOF
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MS，Matrix
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assisted LaserDesorption/
Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry)是一种针对生物分子分析的高灵敏软电离生物质谱技术，MALDI
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MS的简单、快速、准确和低成本是其最大的优势，在生物大分子包括肽、蛋白质、核酸、小分子等的分析中起着关键作用。MALDI
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MS具有高分辨率、高通量、高灵敏度、高耐盐性和样本量小的特点，为药物高通量筛选提供了有力的技术支撑。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于MALDI
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MS体外筛选hMAT2A蛋白抑制剂的方法，可以快速地获得待测药物的效果，从而快速判断出待测药物对hMAT2A蛋白的抑制作用。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种基于MALDI
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TOF
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MS体外筛选hMAT2A蛋白抑制剂的方法，所述方法包括如下步骤：
[0010]将待测药物、hMAT2A和反应液混合孵育，然后加入ATP和L
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Met进行反应，离心后得到实验组上清；
[0011]将二次纯化水、hMAT2A和反应液混合孵育，然后加入ATP和L
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Met
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D3进行反应，离心后得到对照组上清；
[0012]将实验组上清与对照组上清混合得到待测样本，所述待测样本与基质混合后进行MALDI
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TOF
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MS测试，通过比较实验组与对照组的峰强度即可判断待测药物对hMAT2A蛋白的抑制效果。
[0013]优选的，所述反应液由100mM Hepes溶液、50mM KCl溶液和10mM MgCl2溶液组成。
[0014]优选的，所述孵育的温度为20
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30℃，时间为30
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60min。
[0015]优选的，所述待测药物、hMAT2A和反应液的体积比为(0.5～1):(0.2～1):(6.2～7.5)；所述待测药物、ATP和L
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Met的体积比为(0.5～1):1:(0.8～1)。
[0016]优选的，所述反应的温度为20
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30℃，时间为30
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60min。
[0017]优选的，所述实验组上清与对照组上清的体积比为1:1。
[0018]优选的，所述待测样本与基质的体积比为1:1。
[0019]优选的，所述基质为THAP、DHB或CHCA中的任意一种。
[0020]优选的，所述MALDI
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MS测试的条件为：分子量扫描范围为0～1000kDa，激光器能量为12％
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36％。
[0021]本专利技术还提供了上述的方法在体外高通量筛选hMAT2A蛋白抑制剂中的应用。
[0022]本专利技术的有益效果：
[0023]本专利技术提供了一种基于MALDI
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MS体外筛选hMAT2A蛋白抑制剂的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于MALDI
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MS体外筛选hMAT2A蛋白抑制剂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待测药物、hMAT2A和反应液混合孵育，然后加入ATP和L
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Met进行反应，离心后得到实验组上清；将二次纯化水、hMAT2A和反应液混合孵育，然后加入ATP和L
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Met
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D3进行反应，离心后得到对照组上清；将实验组上清与对照组上清混合得到待测样本，所述待测样本与基质混合后进行MALDI
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MS测试，通过比较实验组与对照组的峰强度即可判断待测药物对hMAT2A蛋白的抑制效果。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应液由100mM Hepes溶液、50mM KCl溶液和10mM MgCl2溶液组成。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为20
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30℃，时间为30
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60min。4.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：高祥，郑玲娜，陈春景，赵玉芬，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：