一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，涉及胚性愈伤组织培养技术领域。步骤包括：S1、获取外植体；S2、初级愈伤组织培养基进行诱导和培养；S3、初级愈伤组织的继代培养基，进行继代培养；S4、胚性愈伤组织的和培养。本发明专利技术通过步骤S1获取合适的外植体，并进行灭菌处理，然后将灭菌后的外植体放入初级愈伤组织培养基上进行初级愈伤组织的培养，获得初级愈伤组织后转入继代培养基进行继代培养，最后将经过多次继代培养的继代愈伤组织转入胚性愈伤组织培养基进行诱导、培养，获得大量的胚性愈伤组织，便于后期的转基因实验。基因实验。基因实验。

【技术实现步骤摘要】
一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法


[0001]本专利技术属于胚性愈伤组织培养
，特别是涉及一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法。

技术介绍

[0002]黑籽南瓜是云南省特有的蔬菜资源，具有优良的抗逆和抗病能力，尤其对瓜类枯萎病具有高抗性，具有十分重要的生产价值及科研价值，为了方便后期的转基因实验，需要快速培养和获取黑籽南瓜的胚性愈伤组织。对此，我们设计一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法来解决上述问题。

技术实现思路

[0003]为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0004]本专利技术为一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：
[0005]S1、获取外植体，并进行处理后转入S2；
[0006]S2、初级愈伤组织培养基进行诱导和培养，得到初级愈伤组织后转入S3；
[0007]S3、初级愈伤组织继代培养基，多次继代培养后转入S4；
[0008]S4、胚性愈伤组织的和培养。
[0009]优选地，所述步骤S1中所采取的措施包括以下步骤：
[0010]S11、选择健康的黑籽南瓜植株，剪取植株嫩叶；
[0011]S12、将剪取的植株嫩叶在流动的水下冲洗，然后转入超净工作台；
[0012]S13、对冲洗后的植株嫩叶进行灭菌处理；
[0013]S14、对灭菌后的植株嫩叶进一步进行处理。
[0014]优选地，所述步骤S13采取的措施包括以下步骤：
[0015]S130、采用70％的酒精+0.15％的氯化汞浸泡处理2分钟；
[0016]S131、采用无菌水冲洗2
‑
3次；
[0017]S132、采用2％的次氯酸钠消毒20分钟；
[0018]S134、采用0.1％的升汞溶液消毒2分钟；
[0019]S135、采用无菌水冲洗5
‑
8次。
[0020]优选地，所述步骤S14中所采取的措施包括以下步骤：
[0021]S140、剔除叶片上主脉和边缘部分；
[0022]S141、将处理后的叶片剪成1cm
×
1cm大小的方块。
[0023]优选地，所述步骤S2中采取的措施包括以下步骤：
[0024]S21、采用含有30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基；
[0025]S22、所述步骤S21中加入10mg/L的维生素B1、1mg/L的维生素B6、1mg/L的甘氨酸、1mg/L的烟酸、100mg/L的肌醇、100mg/L的水解酪蛋白、400mg/L的麦芽提取物、以及4g/L的
植物凝胶；
[0026]S23、所述步骤S21中还需加入2mg/L的BA、1mg/L的NAA以及0
‑
6mg/L的TDZ；
[0027]S24、采用暗培养，并控制培养温度在25
±
1℃，培养4
‑
5周。
[0028]优选地，所述步骤S3所采取的措施包括以下步骤；
[0029]S31、将步骤S2中得到的初级愈伤组织转移至继代培养基中，且所述继代培养基与初级愈伤组织培养基相同；
[0030]S32、全天24h光照，光照强度控制在1500
‑
2000lx，控制温度在23
±
1℃。
[0031]优选地，所述步骤S4所采取的措施包括以下步骤：
[0032]S41、将继代培养后的愈伤组织转移至胚性愈伤组织培养基；
[0033]S42、所述胚性愈伤组织培养基采用含有30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基；
[0034]S43、所述步骤S42中加入20mg/L的维生素B1、20mg/L的甘氨酸、40mg/L的半胱氨酸、200mg/L的肌醇、200mg/L的水解酪蛋白、800mg/L的麦芽提取物、60mg/L的硫酸腺嘌呤以及4g/L的植物凝胶；
[0035]S44、所述步骤S43中还需加入1.5mg/L的BA、0.2mg/L的NAA以及0.5mg/L的TDZ；
[0036]S45、采用12h光照，光照强度在1000
‑
2000lx之间，温度25℃的环境下进行。
[0037]优选地，所述步骤S2、S3以及S4中PH均控制在5.6
‑
5.8。
[0038]本专利技术具有以下有益效果：
[0039]1.本专利技术通过对外植体进行多次灭菌处理，提高了外植体的灭菌效果，有效防止后续愈伤组织的诱导、培养过程，出现组培污染的现象，保证了愈伤组织培养的稳定；
[0040]2.本专利技术通过从外植体的培养到初级愈伤组织诱导，初级愈伤组织增殖分化，得到继代培养组织，最后进行胚性愈伤组织的诱导、培养，培养期间通过调整不同激素的浓度，有效提高了愈伤组织的诱导效率，缩短了愈伤组织的诱导、培养时间，达到快速获取愈伤组织的目的，便于黑籽南瓜的快速繁殖以及后期的转基因实验。
[0041]当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
[0042]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0043]图1为本专利技术一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法的框图。
具体实施方式
[0044]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0045]请参阅图1所示，本专利技术为一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：
[0046]S1、获取外植体，并进行处理后转入S2；
[0047]S2、初级愈伤组织培养基进行诱导和培养，得到初级愈伤组织后转入S3；
[0048]S3、初级愈伤组织继代培养基，多次继代培养后转入S4；
[0049]S4、胚性愈伤组织的和培养。
[0050]步骤S1中所采取的措施包括以下步骤：
[0051]S11、选择健康的黑籽南瓜植株，剪取植株嫩叶；
[0052]S12、将剪取的植株嫩叶在流动的水下冲洗，然后转入超净工作台，通过采用流动水冲洗2h,对植株嫩叶进行清洁，便于后续的进一步灭菌处理；
[0053]S13、对冲洗后的植株嫩叶进行灭菌处理；
[0054]S14、对灭菌后的植株嫩叶进一步进行处理。
[0055]步骤S13采取的措施包括以下步骤：
[0056]S130本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、获取外植体，并进行处理后转入S2；S2、初级愈伤组织培养基进行诱导和培养，得到初级愈伤组织后转入S3；S3、初级愈伤组织继代培养基，多次继代培养后转入S4；S4、胚性愈伤组织的和培养。2.根据权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤S1中所采取的措施包括以下步骤：S11、选择健康的黑籽南瓜植株，剪取植株嫩叶；S12、将剪取的植株嫩叶在流动的水下冲洗，然后转入超净工作台；S13、对冲洗后的植株嫩叶进行灭菌处理；S14、对灭菌后的植株嫩叶进一步进行处理。3.根据权利要求2所述的一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤S13采取的措施包括以下步骤：S130、采用70％的酒精+0.15％的氯化汞浸泡处理2分钟；S131、采用无菌水冲洗2
‑
3次；S132、采用2％的次氯酸钠消毒20分钟；S134、采用0.1％的升汞溶液消毒2分钟；S135、采用无菌水冲洗5
‑
8次。4.根据权利要求3所述的一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤S14中所采取的措施包括以下步骤：S140、剔除叶片上主脉和边缘部分；S141、将处理后的叶片剪成1cm
×
1cm大小的方块。5.根据权利要求4所述的一种基于体细胞胚途径获取黑籽南瓜胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤S2中采取的措施包括以下步骤：S21、采用含有30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基；S22、所述步骤S21中加入10mg/L的维生素B1、1mg/L的维生素B6、1mg/L的甘氨酸、1mg/L的烟酸、100mg/L的肌醇、100mg/L的水...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺水莲，杨正安，杨扬，李耕耘，谢俊俊，吴红芝，孟静，李雪娇，赵雁，张杰，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：