APOE4基因编辑犬体细胞的建立方法技术

本发明专利技术涉及通过基因编辑技术建立APOE4基因编辑犬体细胞的方法，以及获得人APOE4基因表达的犬单克隆细胞系。本发明专利技术提供的人APOE4基因表达的基因编辑犬体细胞可用于后续利用体细胞克隆及胚胎移植获得人APOE4基因表达的阿尔兹海默病模型犬，为研究人APOE4基因产物的作用机制，和阿尔兹海默病疾病的发病机制和早期干预提供可靠的大动物模型。早期干预提供可靠的大动物模型。

【技术实现步骤摘要】
APOE4基因编辑犬体细胞的建立方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及APOE4基因编辑犬体细胞的建立方法。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种常见的老年神经退行性疾病，难以治愈。最不利的影响是认知能力下降和记忆丧失。目前约有13％的65岁以上老人和45％的85岁以上老人受到AD的影响。年龄和载脂蛋白E(ApoE)是痴呆和心血管疾病的最大危险因素。
[0003]ApoE表达调控及基因多态性与神经系统或神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、缺血性脑卒中等疾病有重要联系。ApoE有三种亚型:ApoE2、ApoE3和ApoE4，APOE4被认为是发展为阿尔茨海默病(AD)的最强的遗传风险因素。在美国，大约25％的人是APOE4携带者，而APOE4存在于所有AD患者的65
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80％。与APOE3纯合子相比，APOE4的存在使患AD的风险增加了4倍(1个等位基因)到14倍(2个等位基因)。Aβ积累是阿尔兹海默病中患者中典型的病理性变化，淀粉样蛋白
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β(Aβ)的产生和沉积是影响阿尔茨海默病(AD)进展和预后的重要因素,这也会导致血脑屏障(BBB)的损伤，同时，血脑屏障对于维持Aβ的正常代谢也至关重要。Aβ的过度生成和沉积可能在AD发病中起重要作用，而apoE对Aβ代谢和分解代谢具有特异的影响，因为它加剧了Aβ引起的神经病理学和认知衰退。在体内，apoE与神经突淀粉样斑块相关。在体外，无脂apoE3和apoE4能与Aβ多肽形成稳定的复合物；apoE4与Aβ多肽形成稳定的复合物更快更有效。这些配合物耐受十二烷基硫酸钠和盐酸胍稳定配合物的降解。apoE4增强了锌和铜诱导的Aβ聚集。ApoE4片段也以神经元的线粒体为靶点，导致线粒体功能障碍和神经毒性。
[0004]先后开发了人APOE4(human APOE4)的大小鼠模型，以探索APOE4基因与AD相关疾病发生发展的关系。人APOE4转基因小鼠模型虽然表现出与阿尔兹海默病过程中观察到的非常相似的多种表型。然而，在人类阿尔兹海默病患者中看到的一些常见表型，如Aβ积累，在人APOE4小鼠中看不到。相比于小鼠模型，大动物模型与人的生理学特征的相似性使其能够更准确模拟人类疾病，全基因组测序表明犬基因组与人类的相似度高于小鼠等其他实验动物。犬在遗传性疾病方面与人类也极为相似，适于作为人类疾病研究的模式动物。但目前为止，阿尔兹海默病有关的基因工程大动物模型的开发尚处于较为浅显阶段，还没有较好的能模拟人阿尔兹海默病的大动物模型商业化，在一定程度上限制了阿尔兹海默病疾病发病机制和治疗方法的研究。
[0005]目前亟需开发大动物模型，用于探索人APOE4基因在阿尔兹海默病疾病中作用机制及其用于治疗方法开发等。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种通过基因编辑技术建立APOE4基因编辑犬体细胞的方法，以及由该方法获得人APOE4基因表达的犬体细胞。
[0007]第一方面，本专利技术提供APOE4基因编辑犬体细胞的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术获得人APOE4基因表达的犬体细胞。
[0008]在一些实施方式，所述方法包括如下步骤：
[0009](1)对人APOE4基因的CDS区编码序列进行酶切，获得酶切产物；
[0010](2)将获得的酶切产物与线性化的骨架载体连接构建人APOE4表达载体；
[0011](3)将获得的人APOE4表达载体转染至犬体细胞，获得APOE4基因编辑犬体细胞。
[0012]在一些实施方式中，所述表达载体包括真核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒表达载体或非病毒载体。
[0013]在一些实施方式中，所述体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。
[0014]在一些实施方式中，所述体细胞选自干细胞、皮肤细胞、耳细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞和成骨细胞。在一些具体实施方式中，所述犬体细胞为犬胚胎成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞。在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：(1)全基因合成人APOE4基因编码序列，克隆连接至真核表达载体上，构建人APOE4表达载体；(2)通过测序筛选阳性克隆；(3)将测序正确的阳性克隆提取质粒，转染犬胚胎成纤维细胞；(4)使用G418筛选细胞后，提取阳性细胞基因组并通过PCR和测序验证外源基因的整合；(5)有限稀释法制备单克隆细胞株，并进行PCR和测序验证。
[0015]在一些具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：全基因合成人APOE4基因编码序列，克隆连接至真核表达载体pcDNA3.1+上，构建表达载体pcDNA3.1+
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hAPOE4，随后对阳性克隆进行测序验证。测序正确的阳性克隆提取质粒，转染犬胚胎成纤维细胞，使用G418筛选细胞后，提取阳性细胞基因组并通过PCR和测序验证外源基因的整合，有限稀释法制备单克隆细胞株，并进行PCR和测序验证。冻存测序正确的阳性细胞株。
[0016]第二方面，本专利技术提供了由第一方面的方法获得的人APOE4基因表达的犬单克隆细胞系。
[0017]在一些实施方式中，所述体细胞包含SEQ ID NO:2所示的如下序列：
[0018]CCAAAATGTCGTAACAACTCCGccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctgGCTAGCATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAGGAGTTGAAGGCCTACAAATCGGAACTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGCGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.APOE4基因编辑犬体细胞的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术获得人APOE4基因表达的犬体细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)对人APOE4基因的CDS区编码序列进行酶切，获得酶切产物；(2)将获得的酶切产物与线性化的骨架载体连接构建人APOE4表达载体；(3)将获得的人APOE4表达载体转染至犬体细胞，获得APOE4基因编辑犬体细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述骨架载体包括真核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒表达载体或非病毒载体。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述体细胞选自干细胞、胎儿成纤维细胞、上皮细胞、耳细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞和成骨细胞。6.由权利要求1
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5任一项的方法获得的人APOE4基因表达的犬单克隆细胞系。7.根据权利要求6所述的体细胞，其特征在于，所述体细胞包含SEQ ID NO:2所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：米继东，赵建平，郑敏，
申请(专利权)人：北京希诺因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：