关键病毒感染性鉴定方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种关键病毒感染性鉴定方法及应用，涉及病毒核酸检测技术领域。该方法包括步骤：S1、采集样本，预处理后分为三份；S2、第一份样本提取核酸，直接进行qPCR反应，检测CT值为Ct1；第二份样本加入核酸染料孵育、光解，提取核酸，进行qPCR反应，检测CT值为Ct2；第三份样本90℃灭活后，加入核酸染料孵育、光解，提取核酸，进行qPCR反应，检测CT值为Ct3；S3、根据检测的CT值分析、计算并判读样本中病毒的感染性。该鉴定方法可用于消毒效果判定，判定结果准确、可靠，能有效避免因核酸染料与不同病毒之间敏感性差异造成的结果判定不准确的问题。题。题。

【技术实现步骤摘要】
NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述关键病毒为PEDV时，所述qPCR反应中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述关键病毒为PRRSV时，所述qPCR反应中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0010]可选地，仅在所述样本的病毒核酸检测结果为阳性时，才采用所述公式(Ct3
‑
Ct2)/(Ct3
‑
Ct1)
ⅹ
100%计算样本中感染性病毒比例。
[0011]可选地，所述关键病毒为PEDV时，采用PMA作为核酸染料，所述Ct1≤34，则判断样本为阳性；所述关键病毒为PRRSV时，采用PMA作为核酸染料，所述Ct1≤37，则判断样本为阳性；所述关键病毒为ASFV时，采用PMA作为核酸染料，所述Ct1≤36，则判断样本为阳性。
[0012]可选地，在所述步骤S2中，若三份样本进行qPCR反应后无法检测出CT值时，CT值计为40。
[0013]可选地，在所述步骤S2中，孵育和光解具体包括：第三份样本在90℃下加热灭活10min，冷却至室温；第二份样本和灭活后的第三份样本避光各加入核酸染料，混匀；第一份样本加入与核酸染料等体积的ddH2O，混匀；三份样本在37℃下，避光孵育13
‑
20min后，置于冰上冷却；然后置于光解仪中，光解15
‑
>20min。
[0014]如以上任一项所述的关键病毒感染性鉴定方法的应用，用于养殖场环境、物品消毒效果的判定。
[0015]基本原理是：核酸染料是带正电荷的分子，被完整的带负电荷的细菌细胞壁/细胞膜/衣壳蛋白所排斥，但会进入细胞壁/细胞膜/衣壳蛋白受损的细菌，在暗孵育期间染料与DNA/RNA供价结合，经曝光处理后染料对DNA/RNA进行修饰，改变DNA/RNA结构，从而会抑制后续扩增。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的方法将样本分为三份，通过直接进行qPCR、添加核酸染料处理后进行qPCR和灭活后添加核酸染料处理进行qPCR，根据CT值变化来判断样本的感染性；该方法判断结果准确、可靠，能有效避免因核酸染料与不同病毒之间敏感性差异造成的结果判定不准确的问题，且能有效排除现有V
‑
PCR方法（现有V
‑
PCR方法直接添加核酸染料进行qPCR检测CT值，无法测出CT值或CT值大于特定值，就判定不具感染性；反之则判定具有感染性，即阳性）判定样本感染性时存在的假阳性问题。该方法可用于判断消毒效果，快速、有效；用于养殖场消毒效果判定时，能加快养殖场复产效率，降低消毒成本和检测成本，适用性强，易于推广应用。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使
用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0018]图1为实验例1中蓝耳疫苗（PRRSV）样品经不同核酸染料处理的扩增曲线。
[0019]图2为实验例1中PRDV田间样本经不同核酸染料处理的扩增曲线。
[0020]图3为实验例2中不同稀释梯度的蓝耳疫苗（PRRSV）样品经PMA处理的扩增曲线。
[0021]图4为实验例2中不同稀释梯度的PRDV田间样本经PMA处理的扩增曲线（一）。
[0022]图5为实验例2中不同稀释梯度的PRDV田间样本经PMA处理的扩增曲线（二）。
[0023]图6为实验例2中不同稀释梯度的ASFV样本经PMA处理的扩增曲线（一）。
[0024]图7为实验例2中不同稀释梯度的ASFV样本经PMA处理的扩增曲线（二）。
[0025]图8为实验例2中不同稀释梯度的ASFV样本经PMA处理的扩增曲线（三）。
具体实施方式
[0026]下面结合附图对本专利技术的实施例进行详细说明。
[0027]实施例1本专利技术实施例公开了一种关键病毒感染性鉴定方法，该方法适用于鉴定样本中是否存在病毒核酸及该病毒核酸是否为活的具有感染性。
[0028]该方法包括如下步骤：步骤S1、采集样本，对样本进行预处理，然后分为三份备用。
[0029]样本要求为液态，若样本为拭子，则用无酶PBS或ddH2O等溶液将拭子进行洗脱，收集洗脱液；取一定体积的液态样本或洗脱液离心处理，收集上清液，将上清液分为三份备用；若上清液不足的样本，用无酶PBS或ddH2O补足量。
[0030]步骤S2、将第一份样本采用市售试剂盒提取核酸，将提取的核酸样品直接进行qPCR扩增反应，检测CT值，该CT值计为Ct1；向第二份样本中加入核酸染料，孵育、光解，然后采用市售试剂盒提取核酸，提取的核酸样品进行qPCR扩增反应，检测CT值，该CT值计为Ct2；将第三份样本在90℃下加热灭活处理10min，然后加入核酸染料，进行孵育、光解处理，再采用市售试剂盒提取核酸，将提取的核酸样品进行qPCR扩增反应，检测CT值，该CT值计为Ct3。
[0031]具体地，孵育和光解操作时，首先将三份样本各190μL，分别装入三个1.5mL无酶的离心管中；其次将第三份样本在90℃下加热灭活处理10min，充分灭活病毒，冷却至室温；再次将第二份样本和灭活后的第三份样本避光，各加入10μL核酸染料，第一份样本中加入与核酸染料等体积的10μL ddH2O，混匀；然后，将三份样本在37℃下避光孵育13
‑
20min，孵育后立即置于冰水上冷却；最后将三份样本置于光解仪中，光解15
‑
20min，光解结束后无需避光。
[0032]需要特别说明的是，当关键病毒为DNA病毒时，避光孵育时间为15
‑
20min，光解时间为15
‑
20min；当关键病毒为RNA病毒时，避光孵育时间为13
‑
15min，在100W蓝光灯下光解18
‑
20min，孵育和光解时均间隔4
‑
6min摇晃混合一次。
[0033]步骤S3、根据步骤S2中检测的CT值（Ct1、Ct2、Ct3）分析、计算并判读样本中病毒的
感染性。
[0034]具体的，采用公式(Ct3
‑
Ct2)/(Ct3
‑
Ct1)
ⅹ
100%计算样本中感染性病毒的比例，从而判断样本中是否含有感染性病毒（活性病毒），及感染性病毒的含量多少。
[0035]采用公式(Ct3
‑
Ct2)/(Ct3
‑
Ct1)
ⅹ
100%计算样本中感染性病毒比例时，需要在样本的病毒核酸检测结果为阳性时才采本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.关键病毒感染性鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、采集样本，预处理后分为三份；S2、第一份样本提取核酸，直接进行qPCR反应，检测CT值为Ct1；第二份样本加入核酸染料孵育、光解，提取核酸，进行qPCR反应，检测CT值为Ct2；第三份样本90℃灭活后，加入核酸染料孵育、光解，提取核酸，进行qPCR反应，检测CT值为Ct3；S3、根据检测的CT值分析、计算并判读样本中病毒的感染性。2.根据权利要求1所述的关键病毒感染性鉴定方法，其特征在于，所述步骤S3中，根据检测的CT值分析、计算并判读样本中病毒的感染性，具体包括：采用公式(Ct3
‑
Ct2)/(Ct3
‑
Ct1)
ⅹ
100%计算样本中感染性病毒比例。3.根据权利要求2所述的关键病毒感染性鉴定方法，其特征在于，所述核酸染料为PMA、EMA或PMAxx。4.根据权利要求2或3所述的关键病毒感染性鉴定方法，其特征在于，所述关键病毒包括ASFV、PEDV、PRRSV、CSFV、PRV中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的关键病毒感染性鉴定方法，其特征在于：所述关键病毒为ASFV时，所述qPCR反应中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述关键病毒为PEDV时，所述qPCR反应中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述关键病毒为PRRSV时，所述qPCR反应中引物的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晏，曾南方，唐娜娜，闵湘菱，刘佳宇，程陈凯，宁茂，宋天浩，
申请(专利权)人：巨星农牧有限公司，
类型：发明
国别省市：