一种IL1RL2和/或IL36A基因人源化的非人动物及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种IL1RL2和/或IL36A基因人源化的非人动物及其构建方法、一种人源化IL1RL2和/或IL36A蛋白、一种人源化IL1RL2和/或IL36A基因、一种IL1RL2和/或IL36A基因的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人IL1RL2和/或IL36A蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化IL1RL2和/或IL36A蛋白，可以作为人IL1RL2和/或IL36A信号机理研究、炎症、肿瘤或免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种IL1RL2和/或IL36A基因人源化的非人动物及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种IL1RL2和/或IL36A基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]白介素36(IL36)属于IL
‑
1家族成员，在免疫反应中充当着重要角色。人IL36亚家族由IL36A、IL36B、IL36G、IL36受体拮抗剂(IL36 Receptor antagonist，又称IL1RL2a)组成，前三者曾被称为IL1F6、IL1F8、IL1F9，2010年由Dinatello等将其统一更改为现在的名称。IL1RL2a是IL36的天然拮抗剂。IL36在体内需要与特异性受体(IL36 Receptor，又称IL1RL2)结合，招募IL1受体辅助蛋白(IL1 Receptor Accessory Protein，IL1RAcP)形成异源三聚体复合物，激活下游信号通路，通过核转录因子NF
‑
κB启动靶基因的表达，从而发挥促炎症作用。而IL1RL2a会与IL36α、IL36β、IL36γ竞争性结合IL1RL2，但IL1RL2a与IL1RL2结合组成的复合组不能招募IL1RacP，无法激活信号转导通路而起到抗炎症作用。
[0003]IL
‑
36、IL1RL2主要在上皮组织，如皮肤、气管、食道中表达，对树突状细胞有显著的刺激作用，可通过刺激人单核细胞源树突状细胞产生IL1、IL6、IL12、IL23、TNFα、IL6、CCL1和CXCL1等，继而增强Th1和Th17的反应，增强固有免疫反应；此外，还能促进树突状细胞的成熟，上调MHC II分子、CD83和CD86分子的表达，在机体应对组织损伤和病原体的早期免疫反应和炎性反应中发挥重要作用。其中，IL36A是最重要的基因，其过表达即可表现银屑病的典型表型，从功能上IL36A单独存在即可激活下游信号通路。小鼠体内实验证实，抗IL36A抗体可以阻断IL36信号通路(朱超英.IL
‑
36α在咪喹莫特诱导小鼠银屑病皮损中的表达及IL
‑
36抗体对CCL20的影响研究[D].广州:南方科技大学,2017.)。
[0004]实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，例如小鼠的IL36蛋白便不能与人的IL1RL2结合，因此，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
[0005]鉴于IL36信号通路在免疫治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发IL36相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本专利技术在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一方面，提供了一种IL1RL2基因人源化的非人动物的构建方法，所述
的非人动物体内表达人或人源化IL1RL2蛋白。
[0007]优选的，所述的非人动物的内源IL1RL2蛋白表达降低或缺失。
[0008]优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的全部或部分。
[0009]优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。
[0010]进一步优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞外区的全部或部分。
[0011]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白胞外区的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白胞外区至少100、200、250、300、310、311、312、313、314、315、316个连续氨基酸的人IL1RL2蛋白胞外区，进一步优选的，包含人IL1RL2蛋白胞外区316个连续氨基酸；更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第20
‑
335位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第20
‑
335位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[0012]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5、10、15、16、17、18、19个连续氨基酸，进一步优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽19个连续氨基酸；更优选的，信号肽包含与SEQ ID NO:2的第1
‑
19位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第1
‑
19位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列；所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸，例如包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5、10、15、16、17、18、19、20、21个连续氨基酸，优选的，包含人IL1RL2蛋白跨膜区21个连续氨基酸；进一步优选的，跨膜区包含与SEQ ID NO:2的第336
‑
356位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:2的第336
‑
356位所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[0013]优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含2号至9号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分，再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含58bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸序列为止，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、55、60、70、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、144bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含77bp的核苷酸序列；优选的，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种IL1RL2基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化IL1RL2蛋白，所述的非人动物基因组包含人或人源化IL1RL2基因。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的部分，优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白胞外区的全部或部分，更优选的，包含人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸；和/或，包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白包含SEQ ID NO：2第1
‑
356位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1
‑
356位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1
‑
356位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1
‑
356位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2蛋白的部分，优选为非人动物IL1RL2蛋白的胞质区的全部或部分，进一步优选的，包含与SEQ ID NO:1的第360
‑
574位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列；或者，包含SEQ ID NO:1的第360
‑
574位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:1第360
‑
574位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO:1第360
‑
574位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。6.根据权利要求1
‑
5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：a)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的全部或部分；b)包含与SEQ ID NO:10氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；c)包含与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或d)包含SEQ ID NO:10所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。7.根据权利要求1
‑
6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的部分，优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，更优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列差异不超过10、
9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。8.根据权利要求1
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7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的1号至11号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含非人动物IL1RL2基因的9号至11号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含9号外显子的部分、10号外显子的全部、11号外显子的部分，更优选的，所述的人源化IL1RL2基因包含与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。9.根据权利要求1
‑
8任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物IL1RL2基因座。10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：A)编码人或人源化IL1RL2蛋白的核苷酸序列；B)编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列，优选编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含编码人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选还包含编码人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1
‑
356位氨基酸的核苷酸序列；C)人或人源化IL1RL2基因的核苷酸序列；或，D)人IL1RL2基因的1号至12号外显子的全部或部分，优选的，包含2号至9号外显子的全部或部分，再进一步优选的,包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，进一步优选的，所述的供体核苷酸序列包含与SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列。11.根据权利要求9
‑
10任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入，所述的导入非人动物IL1RL2基因座的导入位置包含非人动物IL1RL2基因的2号外显子，优选的，导入位置为非人动物的2号外显子起始密码子处。12.根据权利要求1
‑
11任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：A)编码人或人源化IL1RL2蛋白的核苷酸序列；B)编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列，优选编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编
码人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1
‑
356位氨基酸的核苷酸序列；C)人或人源化IL1RL2基因的核苷酸序列；或，D)人IL1RL2基因的1号至12号外显子的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，更优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列。13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体还包含5
’
臂和/或3
’
臂，优选的，所述的5
’
臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性，进一步优选的，所述5
’
臂序列如SEQ ID NO：3所示；优选的，所述的3
’
臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述3
’
臂序列如SEQ ID NO：4所示。14.根据权利要求1
‑
13任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将IL1RL2基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自IL36A、PD
‑
1、PD
‑
L1、CD40、OX40、IL6、IL12、IL1RACP、IL23和TNF
‑
α中的至少一种。15.根据权利要求14所述的构建方法，其特征在于，所述其他基因为IL36A，所述IL36A基因为人源化IL36A基因，优选的，所述的人源化IL36A基因包含人IL36A基因的1号外显子至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，更优选的，所述的人源化IL36A基因包含SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。16.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：A)编码人或人源化IL1RL2蛋白的核苷酸序列；B)编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人IL1RL2蛋白的信号肽、胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL1RL2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人IL1RL2蛋白的跨膜区和/信号肽的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，优选包含编码人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1
‑
356位氨基
酸的核苷酸序列；C)人或人源化IL1RL2基因的核苷酸序列；或，D)人IL1RL2基因的1号至12号外显子的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2基因的2号至9号外显子的全部或部分，进一步优选的,包含2号外显子的部分、3号至8号外显子的全部、9号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，更进一步优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:5和/或6所示核苷酸序列。17.根据权利要求16所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5
’
臂，优选的，所述的5
’
臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述5
’
臂序列如SEQ ID NO:3所示；和/或，所述的靶向载体还包含3
’
臂，优选的，所述的3
’
臂与NCBI登录号为NC_000067.6的核苷酸至少具有90％同源性；进一步优选的，所述的3
’
臂序列如SEQ ID NO:4所示。18.一种人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的全部或部分。19.根据权利要求18所述的人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分，优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白包含人IL1RL2蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸。20.根据权利要求18或19所述的人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含人IL1RL2蛋白的跨膜区和/或信号肽的全部或部分，优选的，包含人IL1RL2蛋白信号肽至少5个连续氨基酸，和/或，包含人IL1RL2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸。21.根据权利要求18
‑
20任一所述的人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白包含SEQ ID NO:2的第1
‑
356位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:2的第1
‑
356位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:2的第1
‑
356位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO:2的第1
‑
356位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。22.根据权利要求18
‑
21任一所述的人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2蛋白的部分，优选的，所述的人源化IL1RL2蛋白还包含非人动物IL1RL2蛋白的胞质区的全部或部分，优选包含SEQ ID NO:1第360
‑
574位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO:1第360
‑
574位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO:1第360
‑
574位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO:1第360
‑
574位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。23.根据权利要求18
‑
22任一所述的人源化IL1RL2蛋白，其特征在于，所述的人源化IL1RL2蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：a)包含SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：周小飞，常佳慧，李冲，白志芳，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：