诱导多能干细胞外泌体及其在制备抗衰老制剂的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种诱导多能干细胞外泌体及其在制备抗衰老制剂的应用。本发明专利技术通过离得到胚胎干细胞和成体表皮干细胞，对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2基因改造的胚胎干细胞。将成体表皮干细胞作为饲养层细胞对其进行细胞编程，得到诱导多能干细胞，并通过刺激得到其分泌的外泌体，发现该外泌体能够表达SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2基因，并且具有改善D

【技术实现步骤摘要】
诱导多能干细胞外泌体及其在制备抗衰老制剂的应用


[0001]本专利技术涉及诱导多能干细胞
，具体涉及诱导多能干细胞外泌体及其在制备抗衰老制剂的应用。

技术介绍

[0002]诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)，是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4,Sox2、c
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Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。iPSCs在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选以及神经系统疾病、心血管疾病等临床疾病治疗等方面具有巨大的潜在价值。

技术实现思路

[0003]为此，本专利技术通过离得到胚胎干细胞和成体表皮干细胞，对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2基因改造的胚胎干细胞。将成体表皮干细胞作为饲养层细胞对其进行细胞编程，得到诱导多能干细胞，并通过刺激得到其分泌的外泌体，发现该外泌体能够表达SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2基因，并且具有改善D
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半乳糖的衰老型小鼠的体重，清除小鼠体内自由基抑制机体氧化反应可改善衰老，保护肝脏；通过调控衰老蛋白Sirt3、Sirt4、Sirt5和p53含量，抑制促细胞凋亡基因Bax表达量的增多，对抗机体衰老。为此，本专利技术至少公开了如下技术方案：
[0004]第一方面，本专利技术提供了一种诱导多能干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
[0005]分离来自脐带组织的胚胎干细胞和成体表皮干细胞；
[0006]对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造，获得基因改造的胚胎干细胞；
[0007]以成体表皮干细胞作为饲养层细胞对所述基因改造的胚胎干细胞进行共培养，分化得到诱导多能干细胞；
[0008]对诱导多能干细胞进行刺激得到外泌体。
[0009]进一步的，“对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造”的步骤包括：
[0010]构建携带SIRT3和GFP基因的第一病毒载体、携带SIRT4和GFP基因的第二病毒载体，携带SIRT5和GFP基因的第三病毒载体，以及携带Sox2和GFP基因的第四病毒载体；
[0011]分别将所述第一病毒载体、所述第二病毒载体、所述第三病毒载体和所述第四病毒载体转染293T细胞培养液，得到第一病毒液、第二病毒液、第三病毒液和第四病毒液；
[0012]将所述第一病毒液感染胚胎干细胞，收获得到包装的第一逆转录病毒液；
[0013]再将所述第一逆转录病毒液和所述第二病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第二逆转录病毒液；
[0014]将所述第二逆转录病毒液和所述第三病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第三逆转录病毒液；
[0015]将所述第三逆转录病毒液和所述第四病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到以SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造的胚胎干细胞。
[0016]进一步的，“对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造”的步骤包括：
[0017]分别构建携带SIRT3、SIRT4和GFP基因的第五病毒载体，携带SIRT5和GFP基因的第三病毒载体以及携带Sox2和GFP基因的第四病毒载体；
[0018]将所述第三病毒载体、所述第四病毒载体和所述第五病毒载体分别转染293T细胞培养液，得到第三病毒液、第四病毒液和第五病毒液；
[0019]将所述第三病毒液感染胚胎干细胞，收获得到包装的第三逆转录病毒液；
[0020]将所述第三逆转录病毒液和所述第四病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第四逆转录病毒液；
[0021]将所述第四病毒逆转录病毒液和所述第五病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到以SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造的胚胎干细胞。
[0022]进一步的，所述第一病毒载体的构建方法包括：获得SIRT3基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.1所示的SIRT3
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F和如SEQ ID NO.2所示的SIRT3
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R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX
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IRES
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GFP逆转录病毒载体在T4 DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到第一病毒载体；
[0023]所述第二病毒载体的构建方法包括：获得SIRT4基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.3所示的SIRT4
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F和如SEQ ID NO.4所示的SIRT4
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R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX
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IRES
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GFP逆转录病毒载体在T4DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到所述第二病毒载体；
[0024]所述第三病毒载体的构建方法包括：获得SIRT5基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.5所示的SIRT5
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F和如SEQ ID NO.6所示的SIRT5
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R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX
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IRES
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GFP逆转录病毒载体在T4DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到所述第三病毒载体；
[0025]所述第四病毒载体的构建方法包括：获得Sox2基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.7所示的SIRT5
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F和如SEQ ID NO.8所示的SIRT5
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R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX
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IRES
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GFP逆转录病毒载体在T4DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到第四病毒载体。
[0026]进一步的，所述第五病毒载体的构建方法包括：
[0027]通过重叠延伸技术扩增得到SIRT3和SIRT4的融合目的片段，再将该融合目的片段与经BamH I和HindⅢ双酶切后PMX
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IRES
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GFP逆转录病毒载体在T4 DNA连接酶作用下，于4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导多能干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：分离来自脐带组织的胚胎干细胞和成体表皮干细胞；对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造，获得基因改造的胚胎干细胞；以成体表皮干细胞作为饲养层细胞对所述基因改造的胚胎干细胞进行共培养，分化得到诱导多能干细胞；对诱导多能干细胞进行刺激得到外泌体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，“对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造”的步骤包括：构建携带SIRT3和GFP基因的第一病毒载体、携带SIRT4和GFP基因的第二病毒载体，携带SIRT5和GFP基因的第三病毒载体，以及携带Sox2和GFP基因的第四病毒载体；分别将所述第一病毒载体、所述第二病毒载体、所述第三病毒载体和所述第四病毒载体转染293T细胞培养液，得到第一病毒液、第二病毒液、第三病毒液和第四病毒液；将所述第一病毒液感染胚胎干细胞，收获得到包装的第一逆转录病毒液；再将所述第一逆转录病毒液和所述第二病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第二逆转录病毒液；将所述第二逆转录病毒液和所述第三病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第三逆转录病毒液；将所述第三逆转录病毒液和所述第四病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到以SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造的胚胎干细胞。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，“对胚胎干细胞进行SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造”的步骤包括：分别构建携带SIRT3、SIRT4和GFP基因的第五病毒载体，携带SIRT5和GFP基因的第三病毒载体以及携带Sox2和GFP基因的第四病毒载体；将所述第三病毒载体、所述第四病毒载体和所述第五病毒载体分别转染293T细胞培养液，得到第三病毒液、第四病毒液和第五病毒液；将所述第三病毒液感染胚胎干细胞，收获得到包装的第三逆转录病毒液；将所述第三逆转录病毒液和所述第四病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到包装的第四逆转录病毒液；将所述第四病毒逆转录病毒液和所述第五病毒液同时感染胚胎干细胞，收获得到以SIRT3、SIRT4、SIRT5、Sox2和GFP基因改造的胚胎干细胞。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一病毒载体的构建方法包括：获得SIRT3基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.1所示的SIRT3
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F和如SEQ ID NO.2所示的SIRT3
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R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX
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IRES
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GFP逆转录病毒载体在T4 DNA连接酶作用连接，连接产物转化至DH5α中，细菌转化及克隆筛选，提取载体和酶切鉴定，即可得到第一病毒载体；所述第二病毒载体的构建方法包括：获得SIRT4基因的cDNA，采用如SEQ ID NO.3所示的SIRT4
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F和如SEQ ID NO.4所示的SIRT4
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R引物对其进行扩增，回收得到扩增产物与经BamH I和HindⅢ双酶切的PMX
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IRES
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GFP...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱源源，
申请(专利权)人：上海圣石生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：