表达微缩抗肌营养不良蛋白基因的腺相关病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了表达微缩抗肌营养不良蛋白基因的腺相关病毒载体及其应用。人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码本发明专利技术所述的人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin的基因，序列如SEQID NO.3所示。在此基础上，我们使用了肌肉组织特异性启动子，可在C2C12肌肉细胞中高效地产生微缩抗肌营养不良蛋白。最后，我们构建高效组织特异表达微缩抗肌营养不良蛋白的AAV9病毒载体及重组腺相关病毒，可在DMD疾病模型中高效的转导肌肉细胞，并高效地表达有功能的截短的抗肌营养不良蛋白，实现DMD治疗的目标。实现DMD治疗的目标。实现DMD治疗的目标。

【技术实现步骤摘要】
表达微缩抗肌营养不良蛋白基因的腺相关病毒载体及其应用


[0001]本专利技术属于基因药物领域，涉及表达微缩抗肌营养不良蛋白基因的腺相关病毒载体及其应用。

技术介绍

[0002]杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一种X染色体连锁的隐性遗传性疾病，患者自婴幼儿时期发病，神经肌肉障碍表现为进行性肌肉无力、萎缩、消瘦、脂肪浸润和纤维化，从而导致患者自主行走能力逐渐丧失、呼吸衰竭、心肌病和过早的死亡(PMID:33602943)。DMD发病原因是抗肌营养不良蛋白(dystrophin)基因的突变，从而导致dystrophin蛋白表达的缺失。
[0003]dystrophin基因由79个外显子组成，编码形成分子量为427kDa的dystrophin蛋白(PMID:7719347)。Dystrophin蛋白由四个结构域组成：N端结构域；棒状结构域；半胱氨酸富集结构域和C端结构域(PMID:3607877)。Dystrophin是一种细胞骨架蛋白，与肌聚糖、肌酵素、神经元一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)等共同组成dystrophin相关蛋白复合物，参与细胞信号转导，在肌纤维膜的稳定中起着至关重要的作用(PMID:26140716)。Dystrophin的缺失会导致肌膜的易损性增强，继而在收缩过程中诱导肌纤维分裂、功能缺血、自由基介导的氧化损伤和胞质钙超载，最终导致线粒体功能障碍和肌纤维死亡(PMID:3173492；PMID:18345011；PMID:11087833)。此外，由于DMD患者肌纤维再生能力的受损，会导致肌肉组织逐渐发生纤维化(PMID:26246170)。引发DMD的基因突变主要为移码突变和无义突变，从而导致dystrophin蛋白表达的完全缺失(PMID:21399986)。
[0004]随着医疗水平的发展与进步，越来越多的针对DMD的新兴治疗技术和治疗手段逐渐进入大众视野，如干细胞疗法、外显子跳跃法、基因编辑法和基因替代法等。2021年2月Sarepta Therapeutics公司的Amondys 45(商品名casimersen)，被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准，可用于具有45号外显子跳跃基因突变的DMD患者。该款药物为一种磷酸二酰胺吗啉寡聚物，利用外显子跳跃疗法，即通过改变表达抗肌营养不良蛋白的mRNA的剪接过程，跳过让蛋白合成过早中断的基因变异，这一策略生成的抗肌营养不良蛋白虽然比正常蛋白要小一些，但是保留了大部分与其他蛋白结合的结构域，因此仍然可以行使蛋白的部分正常功能，达到对外显子45跳跃基因突变的DMD患者治疗的目的。
[0005]除了外显子跳跃法和基因编辑法外，备受关注的基因治疗药物还有基因替代疗法，即通过合适的载体，将外源基因导入靶细胞，替代或补偿异常基因实现疾病治疗的目的。目前最领先的是基因疗法SRP
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9001(也称：AAVrh74.MHCK7.micro
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Dystrophin)。该疗法将MHCK7启动子与AAVrh74载体结合，以提供微缩抗肌营养不良蛋白的表达用于恢复DMD患者的肌肉功能。其中微缩抗肌营养不良蛋白的结构包含N端结构域NT、螺旋状重复区R(1,2,3,24)、铰链区H(1,2,4)及半胱氨酸富集功能区CR，排列方式为NT
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H1
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R1
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R2
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R3
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H2
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R24
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H4
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CR。目前，SRP
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9001正在进行临床研究，SRP
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9001中期试验的最新结果未能达到评估改
善的主要功能终点。辉瑞公司开发的fordadistrogene movaparvovec(PF
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06939926)是一款在研静脉注射基因疗法。它将由人类肌肉特异性启动子控制的“迷你”抗肌营养不良蛋白(mini
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dystrophin)转基因装在腺相关病毒9(AAV9)载体中。“迷你”抗肌营养不良蛋白其中的结构包含N端结构域NT、螺旋状重复区R(1,2,22,23,24)、铰链区H(1,3,4)及半胱氨酸富集功能区CR，排列方式为NT
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H1
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R1
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R2
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H3
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R22
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R23
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R24
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H4
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CR。该药物在Ib期临床试验的卧床队列中发生了一例患者死亡。这一消息引发了行业关于基因疗法治疗DMD安全性的新担忧。
[0006]DMD的遗传方式为X染色体隐性遗传，其致病基因是抗肌营养不良蛋白基因，该基因为人体最大的基因，远远超出了单个AAV的最佳包装容量(<4.7kb)。现有针对DMD的基因治疗策略大多采用包装截短的但保留关键结构域的肌营养不良蛋白基因，表达截短的但具有生物学功能的肌营养不良蛋白，解决因完整DMD基因过大无法进行包装的问题。DMD基因治疗策略最关键的是截短蛋白结构的设计，不同结构域的保留或去除将极大程度地影响蛋白功能。有研究针对抗肌营养不良蛋白的结果设计了多种不同结构域组合的截短型的蛋白，不同的结构域组合表现出了不同的体内治疗效果(如抗肌营养不良蛋白阳性肌纤维比例、截短蛋白的表达效果、nNOS的募集能力等)。不同结构域的保留和组合所产生的蛋白显示出了不同的功能特性和表达水平。SRP
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9001和PF
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06939926这两款基因治疗产品均不包含nNOS结合区域R16和R17。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin及其编码基因。
[0008]本专利技术的另一目的是提供表达微缩抗肌营养不良蛋白基因的腺相关病毒载体和重组腺相关病毒。
[0009]本专利技术的又一目的是提供所述基因、腺相关病毒载体、重组腺相关病毒的应用。
[0010]本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
[0011]人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]编码本专利技术所述的人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin的基因。
[0013]作为本专利技术的一种优选，所述的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
[0014]含有编码本专利技术所述的人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin的基因的人μDysco蛋白表达框。
[0015]作为本专利技术的一种优选，所述的人μDysco蛋白表达框由增强子
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启动子
‑
目的基因序列
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述的人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。4.含有权利要求2
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3中任一项所述的基因的人μDysco蛋白表达框。5.根据权利要求4所述的人μDysco蛋白表达框，其特征在于由增强子
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启动子
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目的基因序列
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polyA信号组成或者由启动子
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目的基因序列
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polyA信号组成，其中，启动子选自序列如SEQ ID NO.4所示的的肌肉特异的Spc512启动子、序列如SEQ ID NO.5所示的肌肉特异的MCK启动子、序列如SEQ ID NO.7所示的肌肉特异的CK8启动子；目的基因选自权利要求2
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3中任一项所述的基因。6.根据权利要求5所述的人μDysco蛋白表达框，其特征在于所述的增强子选自序列如SEQ ID NO.6所示的MCK增强子序列，polyA信号序列选自rBG ployA，序列如SEQ ID NO.8所示。7.根据权利要求5所述的所述的人μDysco蛋白表达框，其特征在于人μDysco蛋白表达框的核苷酸序列选自SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.13中的任意一种。8.一种载体，其特征在于含有权利要求2
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3中任一项所述的基因、或权利要求4
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7中任一项所述的人μDysco蛋白表达框。9.根据权利要求8所述的载体，其特征在于所述载体选自以下任意一种重组腺相关病毒载体血清型...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨阳，魏于全，王青楠，
申请(专利权)人：成都金唯科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：