一种基于mTag的靶向测序数据预处理的方法、设备和介质技术

本发明专利技术公开了一种基于mTag的靶向测序数据预处理的方法、设备和介质，属于生物数据处理技术领域。所述方法包括将测序reads基于mTag序列进行分类，包含reads数量较少的mTag类别为第一类别，其余为第二类别，对于各第一类别中各read，基于差异碱基的质量值对其mTag序列进行修正并重新分类；进一步选择包含适当reads数量的mTag类别，并从各mTag类别中选择一条代表性序列。利用本发明专利技术的方法，可以对mTag进行修正，避免PCR过程中或测序过程中引入的错误，并且可以精准地选择合适的mTag类别，还可以精准地选择mTag类别中的代表性序列，使得测序数据利用率更高，检测灵敏度和特异性也更好。异性也更好。异性也更好。

【技术实现步骤摘要】
一种基于mTag的靶向测序数据预处理的方法、设备和介质


[0001]本专利技术属于生物数据处理
，具体地，涉及一种基于mTag的靶向测序数据预处理的方法、设备和介质。

技术介绍

[0002]下一代测序（Next
‑
generation sequencing，NGS）又称为高通量测序（High
‑
throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的边合成边测序技术。高通量测序技术的特点主要有：测序读长短，通量高，准确度高。高通量测序相比一代测序大幅降低了成本，同时保持了较高准确性，并且大幅降低了测序时间，目前高通量测序已经在全组学得到广泛应用。
[0003]高通量测序得到的原始图像数据经碱基识别（BaseCalling）转化为原始测序序列（Sequenced Reads），我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ格式存储，其中包含测序序列（reads）信息以及其对应的测序质量信息。
[0004]FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下所示：@HWI
‑
ST507:248:D29JDACXX:8:1101:1715:1919:1:1:0:ACTTGA/1NTAATATTGGGCTAGAAAGTATCTTTGGGATTGCATGTTTTGATGCAGAATCATTGTGCCGTAGAATGC+BPYccaceceggghhfhhhhhhhhhhffhfhhgfahhchhhhhhfhbfghh_gfhhhhgghefffhhhh其中第一行以“@”开头后跟Illumina测序标识符，包括机器型号、上机次数、试剂型号、第几个lane、在flowcell上的坐标、barcode等；第二行是碱基序列；第三行以“+”开头后跟Illumina测序标识符（为节省存储空间，部分fq文件会省略“＋”后的信息）；第四行是对应第二行碱基序列的质量值，是用来衡量测序准确度的，字符范围[B,h]，对应质量范围[2,40]。第四行每个字符对应的ASCII值减去64，即为该碱基的测序质量值，例如h对应ASCII值为104，104
‑
64=40。质量值越高，测序错误率越低。
[0005]在NGS过程中可能会出现PCR重复，虽然重复似乎是单独的reads，但它们实际上是由于PCR和测序过程中的错误导致的技术噪音。分子标签（mTag）技术是在文库制备过程中与DNA片段连接的随机短核苷酸序列。这些mTag序列充当唯一识别码，将每个reads标记为来自单个片段的扩增，为确定PCR重复提供了更准确的机制。但目前如何对针对PCR重复引入的分子标签技术进行去噪尚缺乏统一的标准和方法。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题中的至少一个，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术第一方面提供一种基于mTag的靶向测序数据预处理的方法，包括以下步骤：S1，mTag分类与修正：将测序reads基于mTag序列进行分类，包含reads数量小于第一阈值P1的mTag类别为第一类别，其余为第二类别，对于各第一类别中各read，基于其mTag
序列中与各第二类别的mTag序列的差异碱基的质量值对其mTag序列进行修正并重新分类；S2，mTag类别选择：选择包含reads数量大于或等于第二阈值P2的mTag类别；S3，代表序列选择：从S2选择的各mTag类别中选择一条代表性序列，其中，P1=3~5；P2=1~10。
[0007]在本专利技术中，靶向测序的测序reads包括接头序列、mTag序列及目标序列。在修正前，首先基于目标序列与参考基因组进行比对，过滤掉无法比对至目标区域的测序reads。
[0008]在本专利技术中，mTag即分子标签（molecule tag），也叫特异性分子标签（Unique Molecular Indentifier，UMI），是一段随机或固定或随机固定混合的核苷酸短序列，通常设计为完全随机的核苷酸序列（如NNNNNN），也可以设计为包含固定碱基和随机碱基的核苷酸序列（如NNNCNNNNGNNNN）。在靶向测序的文库构建过程中，mTag通过连接的方式导入，如同分子条形码一样特异性地标记每个模板。mTag通过给每一个原始DNA片段加上一段特有的核苷酸标签序列，经过文库构建及PCR扩增过程之后，一起进行测序。根据不同的mTag序列区分不同来源的DNA模板，可以分辨哪些是PCR扩增及测序过程中产生的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正携带的突变，从而提高检测的灵敏度和特异性。根据上述分子标签的原理可知，具有相同mTag的测序序列（read）来源于同一DNA模板，因为进行分类时归为一个mTag类别。理论上，不同DNA模板产生的reads数量不会相差太大，如果某个mTag类别包含的reads数量过低，例如低于上述第一阈值P1，有可能是由于PCR过程中产生的错误，导致mTag序列出错，因此需要修正。
[0009]在本专利技术中，第一阈值P1的选择与测序深度也有一定的关系，一般情况下，由于目的区域靶向测序更加经济高效，可以实现500~1000
×
，甚至更高的测序深度，本专利技术设定第一阈值P1=3~10，即包含reads数目低于所述第一阈值时，预设该mTag是由于PCR扩增引入的错误（噪声）或者由于测序错误引入。但是如果经过与第二类别的mTag对比，在综合考虑mTag序列差异碱基的质量值后无法进行修正，则相应的mTag类别可能真实来自某个模板，包含的reads数目少是由于PCR的偏好性导致的，该mTag类别需要被保留用于后续分析。
[0010]在本专利技术中，质量值表示测序质量值，用于衡量测序准确度，即质量值越高，表明测序的错误率越低。测序错误率用E表示，碱基质量值用Q表示，则有下列关系：Q=
‑
10log10(E)若碱基的质量值为10，则错误率为10%；若碱基质量值为20，则错误率为1%；若碱基质量值为30，则错误率为0.1%。
[0011]在本专利技术的一些实施方案中，步骤S1中基于各第一分类中各read的mTag序列中与各第二类别的mTag序列的差异碱基的质量值对其mTag序列进行修正并重新分类的步骤具体包括：S11，将待修正的第一类别的mTag序列分别与各第二类别的mTag序列进行比对，找相似性最高的第二类别，针对所述待修正的第一类别中的各read分别进行修正：
①
如果该read的mTag序列与相似性最高的第二类别的mTag序列的差异碱基位于该第二类别的mTag序列的固定碱基位点，则无论该read的分子标签该差异碱基质量值如何，均修正为该第二类别的mTag序列相应位置上的碱基类型；对于一些捕获测序，引入的mTag序列可能全部是随机的序列，则无需根据本步骤进行修正；
②
如果该read的mTag序列与相似性最高的第二类别的mTag序列的差异碱基位于
该第二类别的mTag序列的随机碱基位点，并且该差异碱基的质量值小于第三阈值P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于mTag的靶向测序数据预处理的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，mTag分类与修正：将测序reads基于mTag序列进行分类，包含reads数量小于第一阈值P1的mTag类别为第一类别，其余为第二类别，对于各第一类别中各read，基于其mTag序列中与各第二类别的mTag序列的差异碱基的质量值对其mTag序列进行修正并重新分类；S2，mTag类别选择：选择包含reads数量大于或等于第二阈值P2的mTag类别；S3，代表序列选择：从S2选择的各mTag类别中选择一条代表性序列，其中，P1=3~5；P2=1~10。2.根据权利要求1所述的一种基于mTag的靶向测序数据预处理的方法，其特征在于，步骤S1中修正并重新分类的步骤具体包括：S11，将待修正的第一类别的mTag序列分别与各第二类别的mTag序列进行比对，找相似性最高的第二类别，针对所述待修正的第一类别中的各read分别进行修正：
①
如果该read的mTag序列与相似性最高的第二类别的mTag序列的差异碱基位于该第二类别的mTag序列的固定碱基位点，则无论该read的分子标签该差异碱基质量值如何，均修正为该第二类别的mTag序列相应位置上的碱基类型；
②
如果该read的mTag序列与相似性最高的第二类别的mTag序列的差异碱基位于该第二类别的mTag序列的随机碱基位点，并且该差异碱基的质量值小于第三阈值P3，则将该差异碱基修正为该第二类别的mTag序列相应位置上的碱基类型，否则不进行修正；
③
若经步骤
①
~
②
进行修正后，该read的mTag序列与相似性最高的第二类别的mTag序列的差异碱基占mTag序列长度比例小于第四阈值P4，则无论差异碱基质量值如何，直接将差异碱基修正为该第二类别的mTag序列相应位置的碱基类型，否则该read的mTag序列所有碱基均不进行修正；
④
对于经步骤
①
~
③
无法完成修正的reads，利用相似性第二高的第二类别重复步骤
①
~
③
，直至与所有第二类别进行上述修正步骤后均无法完成修正，S12，基于修正后的mTag序列对reads重新进行分类，其中，P3=10~13；P4=10%~30%。3.根据权利要求1所述的一种基于mTag的靶向测序数据预处理的方法，其特征在于，所述第二阈值P2利用以下方法确定：S21，选择具有至少N个reads的mTag类别进行分析时，得到在n个样本中位点的均方根误差，均方根误差的计算公式如下：；其中，N为1~5的正整数；RMSE为均方根误差，为第个样本中位点的观察频率，为第个样本中位点的期望频率；S22，N取不同值时，得到不同的RMSE值，将RMSE值最小时对应的N值设置为第二阈值P2。4.根据权利要求1所述的一种基于mTag的靶向测序数据预处理的方法，其特征在于，所述第二阈值P2利用以下方法确定：
S21
’
，基于每种mTag类别对应的reads数和累计reads数绘制散点图；S22
’
，从散点图中第一个点开始，计算任意...

【专利技术属性】
技术研发人员：方超，陈志锋，郎秋蕾，
申请(专利权)人：杭州联川基因诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：