一种抗CD73纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗CD73纳米抗体及其应用，该抗CD73纳米抗体包括框架区FR和互补决定区CDR，互补决定区CDR包含互补决定区CDR1，互补决定区CDR2和互补决定区CDR3。本发明专利技术的抗CD73纳米抗体对CD73具有特异的识别和结合能力，并有望作为治疗性抗体用于癌症。并有望作为治疗性抗体用于癌症。

【技术实现步骤摘要】
一种抗CD73纳米抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及免疫学领域，具体涉及一种抗CD73纳米抗体及其应用。

技术介绍

[0002]肿瘤细胞可以通过诱导和募集各种抑制性免疫细胞、分泌免疫抑制性细胞因子以及产生免疫抑制性代谢物等多种机制逃避抗肿瘤免疫应答。腺苷通路已成为治疗癌症的关键免疫检查点通路，在缺氧的肿瘤微环境中(TME)，CD73(胞外
‑5’‑
核苷酸酶)和CD39(核苷三磷酸二磷水解酶)高度表达通常会发现腺苷升高，催化AMP去磷酸化为腺苷，高浓度的腺苷一方面损害T细胞和自然杀伤(NK)细胞的激活和功能，导致强大的免疫抑制；另一方面增强调节性T细胞(Treg)的功能和巨噬细胞M2的分化，这对免疫细胞的识别和活性有负面影响，从而促进癌症的发生和发展。因此，CD73是TME的主要免疫抑制介质，除了肿瘤细胞固有的CD73对肿瘤细胞增殖、血管生成、侵袭和转移的影响外，肿瘤细胞和免疫细胞表达CD73还通过抑制保护性免疫细胞(如效应性T细胞、NK细胞、DC和B细胞)的功能，同时维持调节性免疫细胞(如Treg、MDSC、TAM和CAF)的功能来削弱抗肿瘤免疫。目前，通过抑制CD39和CD73酶活性来阻断腺苷的产生直接破坏腺苷介导的免疫抑制将会是一种极具前途的治疗策略。研究发现，抗CD73单抗治疗显著延缓了具有完整免疫系统的小鼠的原发性4T1.2和E0771肿瘤的生长，并显著抑制了自发性4T1.2肺转移的发展。此外，抑制CD73活性，并结合免疫检查点封锁(如抗CTLA
‑
4或PD
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1的单克隆抗体)靶向治疗或常规治疗，提高了许多临床前癌症小鼠模型的抗肿瘤效果，在晚期实体瘤患者中也具有很好的临床活性。然而，单克隆抗体对靶点特异性高，但对实体肿瘤的渗透性低，且制造工艺复杂，生产成本高，限制了其在癌症治疗中的应用。
[0003]纳米抗体(Nb)是骆驼科动物体内重链抗体(IgG2和IgG3)的可变区域，被称为是自然界存在的最小的抗原结合片段。与传统全长单克隆抗体(mAb，约150KD)相比，Nb具有分子量小(12
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15KD)，结构更简单，低免疫原性，高组织渗透性、高稳定性、高溶解性和低聚集性以及易于克隆等优点。此外，与mAb同类产品相比，Nb的生产成本显著降低，大多数癌症患者都可以使用。因此应用纳米抗体技术研发一种抗CD73纳米抗体的治疗性抗体具有广阔的前景。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的上述不足，本专利技术提供一种抗CD73纳米抗体及其应用，该纳米抗体对CD73具有特异的识别和结合能力，并有望作为治疗性抗体用于种癌症。
[0005]本专利技术提供以下技术方案：
[0006]一种抗CD73纳米抗体，纳米抗体包括框架区FR和互补决定区CDR，所述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1，互补决定区CDR2和互补决定区CDR3，其中，
[0007]互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，
[0008]互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，
CD73抗原与弗氏不完全佐剂1:1(V：V)混合得到混合液，在骆驼的颈部淋巴结附近左右两侧注射乳化后的混合液1mL，跟踪观察皮下注射包块的吸收情况，以确认免疫正确；第三次免疫在二次免疫3周后，使用0.25mg CD73抗原与弗氏不完全佐剂1:1(V：V)混合得到混合液，在骆驼的颈部淋巴结附近左右两侧注射乳化后的混合液1mL，跟踪观察皮下注射包块的吸收情况，以确认免疫正确；第四次免疫在三次免疫3周后，使用0.25mg CD73抗原与弗氏不完全佐剂1:1(V：V)混合得到混合液在骆驼的颈部淋巴结附近左右两侧注射乳化后的混合液1mL，跟踪观察皮下注射包块的吸收情况，以确认免疫正确；
[0040](2)血清处理和效价检测：在第三次和第四次免疫后1周，采集骆驼外周血2mL，分离血清，将人CD73重组蛋白包被在ELISA 96孔板中，利用ELISA法测定血清中抗体效价，ELISA结果显示骆驼四免血清效价>1：64000，符合建库标准，表明血清中存在抗人CD73的高亲和力抗体；
[0041](3)噬菌体展示免疫抗体库的构建：
[0042]①
采集骆驼第四次免疫后的外周血50mL，分离淋巴细胞PBMC；取2
×
107的PBMC，利用RNA提取试剂盒提取总RNA；取5μg RNA，通过RT
‑
PCR反转录试剂盒获得cDNA；
[0043]②
通过巢式PCR分步获取IgG2和IgG3重链可变区序列，实验步骤如下：
[0044]a.设计1对特异性的巢式外侧引物，以cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，扩增区域为骆驼重链抗体基因的Leader
‑
CH2区域，产物大小为700bp和900bp；通过DNA凝胶电泳，切胶回收700bp PCR产物；
[0045]b.设计巢式内侧引物(5对)，以步骤a所得700bp的第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，扩增区域为骆驼重链抗体可变区VHH片段，产物大小为400bp；使用PCR产物纯化试剂盒对第二轮400bp PCR产物进行纯化回收；
[0046]c.通过酶切连接的方式将步骤b所得重链可变区序列VHH插入到经酶切处理的线性化噬菌粒载体VHH
‑
libTemplate中，获得重组载体，经纯化回收后，转化至超级感受态SS320细胞(含辅助噬菌体M13K07)；转化后的菌液用SOC培养基重悬并活化1h；取菌液进行10倍比梯度稀释，于LB/tet10及LB/Carb50培养板上涂板，置于37℃生化培养箱过夜；剩余菌液转入2YT/Carb50/Kan25液体培养基中，置于37℃摇床，过夜培养，次日收获上清，加入1/4倍体积的PEG/NaCl溶液，沉淀噬菌体后，取PBT溶液重悬，稀释后即得到噬菌体展示免疫抗体库(
‑
80℃保存备用)；
[0047]d.统计步骤c所得LB/Carb50平板上克隆数目，骆驼抗体库Lib CD73Camel的库容为9.23
×
109，从平板上各随机挑取20个单克隆测序，结果表明：骆驼抗体库Lib CD73 Camel的VHH插入效率均为90％。
[0048](4)将5μg/mL的人CD73重组蛋白加入96孔板(100μL/孔)，4℃包被过夜；将NEB5αF
’
大肠杆菌在2YT/Tet10平板划线生长，37℃孵箱过夜培养；第二天，从2YT/Tet10平板上挑取NEB5αF
’
单克隆，加入到3mL2YT/Tet10液体培养基中，37℃摇菌生长至OD600＝0.8；同时去除96孔板的抗原上清液，每孔加入200μL的1％BSA封闭，同时在空白孔加入200μL1％BSA作为阴性对照孔，在室温下置于3D旋转振荡器2h；去除蛋白孔和对照孔的上清液，用200μL PT清洗，各孔加入100μL步骤(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗CD73纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括框架区FR和互补决定区CDR，所述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1，互补决定区CDR2和互补决定区CDR3，其中，所述互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；或者所述互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，所述互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；或者所述互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，所述互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，所述互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。2.根据权利要求1所述的抗CD73纳米抗体，其特征在于，所述框架区FR包括框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4，其中，所述框架区FR1的氨基酸序列SEQ ID NO：1所示，所述框架区FR2的氨基酸序列SEQ ID NO：3所示，所述框架区FR3的氨基酸序列SEQ ID NO：5所示，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：何雯婷，李梅，刘涛，李玉民，
申请(专利权)人：兰州大学第二医院，
类型：发明
国别省市：