一种体外筛选药物的方式制造技术

本发明专利技术公开了一种体外筛选药物的方式，属于药物筛选技术领域，一种体外筛选药物的方式，其特征在于，具体包括以下步骤：提取小鼠肝脏DNA，利用设计好PXR启动子区引物进行PCR扩增，得到PXR启动子区，并进行胶回收得到纯化后的PXR启动子区；对pGL3

【技术实现步骤摘要】
一种体外筛选药物的方式


[0001]本专利技术属于药物筛选
，尤其涉及一种体外筛选药物的方式。

技术介绍

[0002]孕烷X受体(pregnane X receptor，PXR)是由NR1I2基因编码的核受体家族的成员，是动物机体的重要核转录因子之一。PXR在药物代谢和药物相互作用中起到重要作用，临床上约50％药物通过激活PXR介导的CYP3A4酶进行代谢，同时还发现PXR参与到机体的诸多生理、病理过程中，如维持机体细胞增殖分化、生长发育、新陈代谢、稳态维持和多种代谢性疾病、炎症、癌症等。(见Daujat
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Chavanieu Martine等人撰写的《Regulation of CAR and PXR Expression in Health and Disease》，Cells,2020,9:1135
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1143)。PXR活化后可调节药物代谢酶与药物转运蛋白的表达与代谢，其中包括细胞色素酶P450(cytochrome P450，CYP450)、谷胱甘肽转移酶(glutathione
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S
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transferases，GSTs)、葡糖醛酸基转移酶(UDP
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glucuronyl transferases，UGTs)、多药耐药蛋白(multidrug resistance proteins，MDRs)、有机阴离子转运多肽酶(organic anion transport peptidases，OATPs)等(见Wang Jing《Biology of PXR:role in drug
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hormone interactions》，EXCLI J,2014,13:728
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39.)。
[0003]抗菌药物可刺激肝脏解毒的I相酶，并诱发药物性肝损伤，PXR在肝脏药物清除系统中为主要调节因子，在药物性肝损伤过程中起关键作用。利福平、恩诺沙星等抗菌药，均可通过对肝脏CYP450酶产生影响从而对肝脏造成损伤。有研究表明被配体激活的PXR可以通过抑制核因子
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κB(nuclear factor
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κB，NF
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κB)与激活蛋白1(activator protein
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1，AP
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1)在肝脏中的表达从而起到抗炎作用。
[0004]在药物开发前期，对药物进行靶标验证以及对药物的吸收、分布、代谢、消除和毒性等过程进行分析与判断非常重要。当前已有一些进行筛选评估小分子药物药理特性和调控机制的方法，如动物体内试验、高通量LC
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MS
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MS方法等，但由于这些方法的统一问题是成本高、试验周期长，仅能提供有限用途，且费时费力。因此寻求一种快速、高效的药物筛选方法已成为近年来的研究焦点之一。我国中草药资源丰富，有报道表明中药提取物及其天然产物中含有可激活PXR起到治疗疾病的小分子物质。因此快速、高效的筛选PXR诱导剂，不仅有助于研究PXR诱导的CYPs药物
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药物相互作用，还可以为药物研发和临床用药安全提供一定的理论指导。通过构建PXR启动子报告基因在体外对药物进行筛选可以帮助我们高效、准确的获得针对PXR位点的药物，为药物开发提供帮助。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于：为了解决问题，而提出的一种体外筛选药物的方式。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0007]一种体外筛选药物的方式，具体包括以下步骤：
[0008]S1、提取小鼠肝脏DNA，利用设计好PXR启动子区引物进行PCR扩增，得到PXR启动子
区，如图1A所示，并进行胶回收得到纯化后的PXR启动子区；
[0009]S2、对pGL3
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Basic报告基因质粒在Sma I与Nar I两处位点进行酶切，并将纯化得到的PXR启动子区与酶切完成的报告基因质粒进行连接，连接完成的质粒命名为pGL3
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Basic
‑
PXRpro；
[0010]S3、将连接完成的pGL3
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Basic
‑
PXRpro转入DH5α感受态细胞，并在接种在含氨苄的LB固体培养基上，挑选阳性克隆菌落通过PXR启动子区引物进行PCR验证，经过验证的阳性菌落在含氨苄的LB液体培养基中培养，提取质粒，进行双酶切验证，如图1B，得到构建成功的pGL3
‑
Basic
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PXRpro；
[0011]S4、复苏并传代小鼠肝癌细胞(Hela)，待贴壁生长细胞达到95％密度且培养基澄清时，按照1
×
104/孔的密度均匀铺设在96孔板上；
[0012]S5、将构建好的PXR启动子报告基因与对照内参pRL
‑
TK一起瞬时转染至小鼠肝癌细胞内；
[0013]S6、将药物小分子单体按比例稀释好后与转染完毕的小鼠肝癌细胞共同孵育，每组设三个复孔；
[0014]S7、按照Promega报告基因试剂盒说明用GLOMAX 20/20发光检测仪进行双荧光素酶活性测定；
[0015]S701、用ddH2O将5
×
Passive lysis buffer 5倍比稀释，以每孔20μL体积加入到96孔板中，于水平摇床室温轻缓晃动15min，至细胞裂解完全；
[0016]S702、取上述各孔细胞裂解液于EP管中，加50μL LAR II，快速测定萤火虫荧光素酶活性，再加50μL Stop&GLO试剂，测定海肾荧光素酶活性；
[0017]S703、记录萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值，通过与含量为0的阴性对照孔比值进行差异显著性分析，若差异显著则该药物对PXR启动子有激活或抑制作用。
[0018]作为上述技术方案的进一步描述：
[0019]所述S3中，接种在LB固体培养基上后，保持温度37℃，并培养12
‑
14h。
[0020]作为上述技术方案的进一步描述：
[0021]所述S3中，落在含氨苄的LB液体培养基中阳性菌落被培养12
‑
14h。
[0022]作为上述技术方案的进一步描述：
[0023]所述S6中，药物小分子单体为0、20、40、60、80、100μmol/L的比例。
[0024]作为上述技术方案的进一步描述：
[0025]所述S702中，细胞裂解液为10μL，EP管为1.5mL。
[0026]综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
[0027]1、本专利技术建立了一种高效、可靠的筛选小分子药物的工具，首先从小鼠肝脏DNA中提取到PXR启动子区，并通过聚合酶链式反应(PCR)与胶回收等一系列方法进行纯化与扩增，并将其连接至pG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外筛选药物的方式，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、提取小鼠肝脏DNA，利用设计好PXR启动子区引物进行PCR扩增，得到PXR启动子区，并进行胶回收得到纯化后的PXR启动子区；S2、对pGL3
‑
Basic报告基因质粒在Sma I与Nar I两处位点进行酶切，并将纯化得到的PXR启动子区与酶切完成的报告基因质粒进行连接，连接完成的质粒命名为pGL3
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Basic
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PXRpro；S3、将连接完成的pGL3
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Basic
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PXRpro转入DH5α感受态细胞，并在接种在含氨苄的LB固体培养基上，挑选阳性克隆菌落通过PXR启动子区引物进行PCR验证，经过验证的阳性菌落在含氨苄的LB液体培养基中培养，提取质粒得到构建成功的pGL3
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Basic
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PXRpro；S4、复苏并传代小鼠肝癌细胞，待贴壁生长细胞达到95％密度且培养基澄清时，按照1
×
104/孔的密度均匀铺设在96孔板上；S5、将构建好的PXR启动子报告基因与对照内参pRL
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TK一起瞬时转染至小鼠肝癌细胞内；S6、将药物小分子单体按比例稀释好后与转染完毕的小鼠肝癌细胞共同孵育，每组设三个复孔；S7...

【专利技术属性】
技术研发人员：王萌，邱山桐，潘阳阳，王立斌，张倩，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：