用于基因疗法的编码葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase-a)的载体制造技术

本发明专利技术涉及一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含用于在细胞中表达葡萄糖

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因疗法的编码葡萄糖
‑6‑
磷酸酶(G6Pase
‑
a)的载体
专利

[0001]本专利技术涉及一种腺相关病毒(AAV)，其包含用于在细胞中表达葡萄糖
‑6‑
磷酸酶
‑
a(G6Pase
‑
a)的核酸构建体，可用于治疗糖原贮积病Ia(GSD
‑
Ia)，其中编码G6Pase
‑
a的核酸序列可操作地连接至人α
‑
1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。

技术介绍

[0002]Ia型糖原贮积病(GSD
‑
Ia或von Gierke病)是由葡萄糖
‑6‑
磷酸酶
‑
a(G6Pase
‑
a)缺陷引起的，葡萄糖
‑6‑
磷酸酶
‑
a是一种主要在肝脏、肾脏和肠道中表达的酶。G6Pase
‑
a由G6PC基因编码，是通过九个跨膜螺旋锚定在内质网(ER)中的疏水蛋白。该酶在糖原分解和糖异生的最终步骤中催化葡萄糖
‑6‑
磷酸(G6P)水解为葡萄糖和无机磷酸盐。受GSD
‑
Ia影响的患者无法维持葡萄糖稳态，并出现空腹低血糖、生长迟缓、肝肿大、肾肿大、高脂血症、高尿酸血症和乳酸血症(lactic academia)。
[0003]大多数时候，可以使用饮食疗法来控制低血糖症，使患者能够获得接近正常的生长和青春期发育。然而，长期临床并发症及其潜在的病理过程仍未得到纠正。最重要的慢性风险之一是肝细胞腺瘤(HCA)，它在70
‑
80％的25岁以上GSD
‑
I患者中发生。GSD
‑
Ia患者的HCA呈多发性且无包膜，并伴有局部压迫和瘤内出血等并发症。在10％的GSD
‑
Ia患者中，HCA发生恶性转化为肝细胞癌(HCC)。
[0004]因此，需要改进的治疗载体来治疗GSD
‑
1a及其相关并发症。
[0005]使用携带G6Pase
‑
a的重组腺相关病毒(AAV)的基因疗法研究先前已在GSD
‑
Ia动物模型中进行。具体而言，现有技术公开了包含编码G6Pase
‑
a的核酸序列的核酸构建体的用途，所述核酸序列可操作地连接至G6PC启动子/增强子(GPE)。
[0006]与针对载体的免疫应答相关的治疗并发症代表了在基因疗法中使用AAV载体的严重障碍。一般而言，施用较低剂量的AAV载体与较低的免疫应答激活和较好的转基因表达稳定性有关[15]。为了减少与使用AAV载体相关的副作用的出现，因此优选施用足以在受试者中获得治疗有效效果的最低量的AAV载体。
[0007]因此，需要改进的核酸构建体来增加基因疗法中的G6Pase
‑
a表达和活性，从而允许减少在受试者中实现治疗效果所必需的AAV载体的量。
[0008]专利技术概述
[0009]专利技术人令人惊奇地表明，特别是在AAV基因疗法环境中，在hAAT启动子控制下的编码G6Pase
‑
a的核酸导致G6Pase
‑
a表达和G6Pase
‑
a活性增加，与hGPE启动子相比，这允许在GSDIa小鼠中进行表型拯救。考虑到使用源自不同物种的不同形式的G6Pase天然启动子(GPE)来治疗GSDIa的现有技术，这是特别出乎意料的。
[0010]此外，专利技术人还表明，在基因疗法中，与hGPE启动子相比，在hAAT启动子控制下编码G6Pase
‑
a的相同核酸降低了肿瘤形成(例如HCA和HCC)的风险。考虑到现有技术预测具有更高活性的启动子更有可能增加基因疗法后HCA和HCC的风险，这也是特别出乎意料的[1]。
[0011]因此，在第一方面，本专利技术涉及腺相关病毒(AAV)载体，其包含用于在细胞中表达
葡萄糖
‑6‑
磷酸酶
‑
a(G6Pase
‑
a)的核酸构建体，该构建体包含编码G6Pase
‑
a的核酸序列，其中编码G6Pase
‑
a的核酸序列可操作地连接至人α
‑
1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。
[0012]在第二个方面，本专利技术涉及用本专利技术的载体转化的细胞。
[0013]在第三个方面，本专利技术涉及包含本专利技术的载体或本专利技术的细胞的组合物。
[0014]在第四方面，本专利技术涉及本专利技术的载体、细胞或组合物用作药物，特别是用于治疗糖原贮积病Ia(GSD
‑
Ia)。
[0015]附图简述
[0016]图1显示了用AAV载体或PBS治疗15天后GSD
‑
Ia小鼠和WT小鼠中肝脏表型的校正。A.是治疗方案的方案。B.显示治疗方案结束时禁食6小时后测量的血糖。C.显示在肝组织中测量的G6Pase活性。D.显示肝组织的糖原含量。E.显示报告为肝脏/体重百分比的肝肿大。F.显示了在AAV治疗小鼠的肝脏中测量的每个二倍体基因组的载体基因组拷贝数。在A
‑
E中通过方差分析(#P<0.05对比注射PBS的L.G6pc
+/+
小鼠；*P<0.05对比注射PBS的L.G6pc
‑
/
‑
小鼠)和在F中通过t检验(ns，不显著)进行统计分析。
[0017]图2显示了GSD
‑
Ia小鼠中肝脏表型的长期校正。A.代表治疗方案的方案。B.显示在治疗方案结束时(即载体注射后7个月)禁食6小时后测量的血糖，即载体注射后7个月。C.显示在处死时收集的肝组织中测量的G6Pase活性。D.显示在肝组织上测量的糖原含量。E.显示处死时报告为肝脏/体重百分比的肝肿大。F.显示了在AAV治疗小鼠的肝脏中测量的每个二倍体基因组的载体基因组拷贝数。通过方差分析(#P<0.05对比注射PBS的L.G6pc
+/+
小鼠；*P<0.05对比注射PBS的L.G6pc
‑
/
‑
小鼠；如所示)和在F中通过t检验(*P<0.05)进行统计分析。
[0018]图3显示hGPE定向基因疗法促进喂食高脂肪高蔗糖饮食的L.G6pc
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‑
小鼠的肝肿瘤形成。A.代表治疗方案的方案。B.显示在治疗方案结束时(即载体注射后8个月)禁食6小时后测量的血糖即载体注射后8个月。C.显示了对处死时收集的肝组织进行的G6Pase
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a活性测定。D.显示在肝脏中测量的每个二倍体基因组的载体基因组拷贝数。E.显示在HF/HS方案开始后8个月在PBS或AAV载体处理的L.G6pc
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小鼠中观察到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.腺相关病毒(AAV)载体，其包含用于在细胞中表达葡萄糖
‑6‑
磷酸酶
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a(G6Pase
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a)的核酸构建体，该构建体包含编码G6Pase
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a的核酸序列，其中所述编码G6Pase
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a的核酸序列可操作地连接至人α
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1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。2.根据权利要求1所述的AAV载体，其中所述G6Pase
‑
a具有与SEQ ID NO:1至少90％同一性的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2中任一项所述的AAV载体，其中所述编码G6Pase
‑
a的核酸序列包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的核苷酸序列。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的AAV载体，其中所述编码G6Pase
‑
a的核酸序列是密码子优化的，优选地，所述编码G6Pase
‑
a的核酸序列通过在所述编码G6Pase
‑
a的核酸序列中降低GC含量和降低GC二聚体进行密码子优化。5.根据权利要求1至4中任一项所述的AAV载体，其中所述hAAT启动子包含与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的核苷酸序列。6.根据权利要求1至4中任一项所述的AAV载体，其中所述hAAT启动子之前是增强子，例如ApoE增强子(例如SEQ ID NO:9)，优选地，所述核酸构建体包含SEQ ID NO:7。7.根据权利要求1至6中任一项所述的AAV载体，其中所述核酸构建体包含与SEQ ID NO:11，与SEQ ID NO:48，与...

【专利技术属性】
技术研发人员：路易莎，
申请(专利权)人：法国国家健康与医学研究院埃夫里瓦尔德艾松大学克洛德，
类型：发明
国别省市：