用以筛选抗体片段的方法、由此制备的重组抗体及其用途技术

本发明专利技术涉及一种用以筛选对流感病毒具有特异性的抗体片段的方法。根据本发明专利技术内容的某些实施方式，所述流感病毒可为A型流感病毒或B型流感病毒。本发明专利技术也提供筛选出来的抗体、由所述抗体制备的重组抗体，以及其用以诊断流感病毒感染的用途。病毒感染的用途。病毒感染的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用以筛选抗体片段的方法、由此制备的重组抗体及其用途
专利技术背景
[0001]1.

[0002]本专利技术涉及一种用以筛选对流感病毒具有特异性的抗体片段的方法，以及筛选出的抗体片段用于诊断流感病毒感染的用途。
[0003]2.
技术介绍

[0004]酶联免疫吸附测定(Enzyme
‑
linked immunosorbent assay,ELISA)以及侧流式免疫测定法(lateral flow immunoassay,LFIA)为快速进行分子定量/半定量监测的技术。所述免疫测定平台可作为用以预防/治疗疾病、保障食品安全、监测免疫原及控制环境污染的工具。具体而言，LFIA符合世界卫生组织(World Health Organization,WHO)，对于ASSURED(可负担、灵敏、特异、便于操作、快速且准确、不需设备以及可交付)的要求，可作为未经训练的人员在资源缺乏而亟需健康照护及对感染性疾病控制时的疾病诊断工具
[0005]在研发ELISA及LFIA的应用时，经常遭遇不同的挑战。上述两种免疫测定平台的关键组分为与抗体相关的亲和性试剂，所述试剂多来自免疫(immunized)动物的单株或是多株抗体。这些来自动物的抗体作为亲和性试剂有三个缺点：第一，发现及研发动物抗体的时间至少需耗费16
‑
24个月，时间长于一般预防主要疾病恶化的关键时期(例如，人类的流行性感染疾病的爆发)；第二，动物B细胞对于一抗原的反应通常取决于所述抗原少数的用于免疫的B细胞抗原决定簇，造成作为亲和性试剂的动物抗体选择受限；第三，即使已获得可作为亲和性试剂的动物抗体，也无法保证所述抗体具有分辨高度相似的抗原的能力，且最终产品经常不易分辨有毒病原株及与其相关但不具毒性的病原株。
[0006]流感病毒因其快速变异、基因漂变(genetic drift)及基因组重组(genome reassortment)的特性，导致新型流感病毒株的出现，使其可跨越物种的限制感染多种宿主，像是1997年的H5N1、2013年的H7N9、H10N8及H6N1以及2014年的H5N6。快速监测所述新兴的流感病毒株是解决流感大规模爆发及季节性流感对人类社会及经济所造成的威胁的关键方法。用以监测流感病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)的快速流感诊断测试(Rapid influenza diagnostic test,RIDT)，可协助健康照护的专业人员做出立即且有效的治疗决策，并且避免非必要的抗生素及抗病毒药物的处方。LFIA测定法相关的检测A型流感病毒(influenza virus type A,IAV)及B型流感病毒(influenza virus type B,IBV)的测试，已经可以RIDT的形式被广泛地取得，但是所述测试的灵敏度因为落在40％至70％的范围内，无法涵盖持续增加且多样的流感病毒株。
[0007]综上所述，在本专利技术相关领域亟需一种能高效制备抗体的方法，其中所述抗体具有足够的特异性及亲和力，可分辨流感病毒的亚型，以建立用以预防及/或治疗感染的诊断平台。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供本
技术实现思路
的简化摘要，以使阅读者对本
技术实现思路
具备基本的理解。此
技术实现思路
并非本
技术实现思路
的完整概述，且其用意并非在指出本专利技术实施例的重
要/关键组分或限定本专利技术的范围。其唯一目的是以简化的概念形式呈现本
技术实现思路
的一些概念，以作为呈现在后文中更详细描述的序言。
[0009]如本文的实施方式及广泛的描述，本
技术实现思路
的一方面是关于一种用于筛选对流感病毒具有特异性的抗体片段的方法。根据本
技术实现思路
的实施方式，所述方法包含以下步骤：(a)提供一由噬菌体展示的单链可变片段(single
‑
chain variable fragment,scFv)抗体库，其包含复数个由噬菌体展示的scFv，其中每个由噬菌体展示的scFv的重链可变区(heavy chain variable domain,VH domain)对蛋白A具有结合亲和力，以及每个由噬菌体展示的scFv的轻链可变区(light chain variable domain,VL domain)对蛋白质L具有结合亲和力；(b)将步骤(a)所述的由噬菌体展示的scFv抗体库曝露于一个目标核蛋白中，所述目标核蛋白包含一选自：由SEQ ID NO:1
‑
6所组成的组中的氨基酸序列；(c)自步骤(b)所述的由噬菌体展示的scFv抗体库筛选出第一复数个噬菌体，其分别表达与所述目标核蛋白具有结合亲和力的scFv；(d)在具有至少一扰乱核蛋白(scrambled nucleoprotein)存在的情况下，将步骤(c)挑选的所述第一复数个噬菌体曝露于所述目标核蛋白中，其中所述扰乱核蛋白包含一选自：由SEQ ID NO:1
‑
6所组成的组中的氨基酸序列，且所述扰乱核蛋白的氨基酸序列与所述目标核蛋白的氨基酸序列不同；(e)自步骤(d)的所述第一复数个噬菌体挑选一第二复数个噬菌体，其中在扰乱核蛋白存在的情况下，所述第二复数个噬菌体分别表达与所述目标蛋白具有结合亲和力的scFv；(f)分别使步骤(e)挑选的所述第二复数个噬菌体展示复数个可溶性scFv；(g)使步骤(f)的所述复数个可溶性scFv曝露于所述目标核蛋白中；(h)确认步骤(g)中所述复数个可溶性scFv与所述目标蛋白单独结合的亲和力；以及(i)基于步骤(h)的结果，挑选一可溶性scFv作为抗体片段，其中相较于所述复数个可溶性scFv中其他的可溶性scFv，所述作为抗体片段的可溶性scFv与所述目标蛋白具有较优异的亲和性。
[0010]根据本专利技术的某些实施方式，流感病毒为IAV。根据某些实施方式，流感病毒为IBV。在某些示例性的实施方式中，流感病毒为IAV亚型(如，H1N1、H3N2或H5N1)。
[0011]根据上述方法选择的抗体片段适用于制备一重组抗体，其中所述重组抗体用以监测流感病毒的感染，例如：IAV或IBV的感染。根据本专利技术的某些实施方式，25个抗体片段分别为“NP1”至“NP25”，是选自：由噬菌体展示的scFv的抗体库，且根据所述抗体片段制备25个重组抗体。本
技术实现思路
的第二方面是关于一种重组抗体或抗体片段(例如，scFv)，其结构包含一VL结构域和一VH结构域，其中所述VL结构域包含一第一轻链互补决定区(complementarity determining region,CDR
‑
L1)、一第二轻链CDR(CDR
‑
L2)以及一第三轻链CDR(CDR
‑
L3)，且所述VH结构域包含一第一重链CDR(CDR
‑
H1)、一第二重链CDR(CDR
‑
H2)以及一第三重链CDR(CDR
‑
H3)。
[0012]根据某些实施方式，抗体片段NP1的CDR
‑
L1、CDR
‑
L2、CDR
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用以筛选对流感病毒具有特异性的抗体片段的方法，包含：(a)提供一由噬菌体展示的单链可变片段(single
‑
chain variable fragment,scFv)抗体库，其包含复数个由噬菌体展示的scFv，其中每个由噬菌体展示的scFv的重链可变区(heavy chain variabledomain,VH domain)对蛋白A具有结合亲和力，以及每个由噬菌体展示的scFv的轻链可变区(light chain variabledomain,VL domain)对蛋白质L具有结合亲和力；(b)将步骤(a)的所述由噬菌体展示的scFv抗体库曝露于一目标核蛋白中，所述目标核蛋白包含一选自由SEQ ID NO:1
‑
6所组成的组中的氨基酸序列；(c)自步骤(b)的所述由噬菌体展示之scFv抗体库筛选出一第一复数个噬菌体，其分别表达与所述目标核蛋白具有结合亲和力的scFv；(d)在具有至少一扰乱核蛋白(scrambled nucleoprotein)存在的情况下，将步骤(c)挑选的所述第一复数个噬菌体曝露于所述目标核蛋白中，其中所述扰乱核蛋白包含一选自由SEQ ID NO:1
‑
6所组成的组中的氨基酸序列，且所述扰乱核蛋白的氨基酸序列与所述目标核蛋白的氨基酸序列不同；(e)自步骤(d)的所述第一复数个噬菌体挑选一第二复数个噬菌体，其中在扰乱核蛋白存在的情况下，所述第二复数个噬菌体分别表达与所述目标蛋白具有结合亲和力的scFv；(f)使步骤(e)挑选的所述第二复数个噬菌体分别表达复数个可溶性scFv；(g)将步骤(f)的所述复数个可溶性scFv曝露于所述目标核蛋白中；(h)确认步骤(g)中所述复数个可溶性scFv与所述目标蛋白单独的结合亲和力；以及(i)基于步骤(h)的结果，挑选一可溶性scFv作为抗体片段，其中相较于所述复数个可溶性scFv中其他的可溶性scFv，所述作为抗体片段的可溶性scFv与所述目标蛋白具有较优异的亲和性。2.如权利要求1所述的方法，其中所述流感病毒为A型或B型流感病毒。3.如权利要求2所述的方法，其中所述A型流感病毒为H1N1、H3N2或H5N1。4.一种重组抗体或片段，包含一VL结构域以及一VH结构域，其中所述VL结构域包含一第一轻链互补决定区(complementarity determining region,CDR
‑
L1)、一第二轻链CDR(CDR
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L2)及一第三轻链CDR(CDR
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L3)，且所述VH结构域包含一第一重链CDR(CDR
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H1)、一第二重链CDR(CDR
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H2)及一第三重链CDR(CDR
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H3)，其中所述CDR
‑
L1、所述CDR
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L2、所述CDR
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L3、所述CDR
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H1、所述CDR
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H2以及所述CDR
‑
H3分别包含SEQ ID NO:7
‑
12的氨基酸序列；所述CDR
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L1、所述CDR
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L2、所述CDR
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L3、所述CDR
‑
H1、所述CDR
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H2以及所述CDR
‑
H3分别包含SEQ ID NO:13
‑
18的氨基酸序列；所述CDR
‑
L1、所述CDR
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L2、所述CDR
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L3、所述CDR
‑
H1、所述CDR
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H2以及所述CDR
‑
H3分别包含SEQ ID NO:19
‑
24的氨基酸序列；所述CDR
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L1、所述CDR
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L2、所述CDR
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L3、所述CDR
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H1、所述CDR
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H2以及所述CDR
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‑
L1、所述CDR
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36的氨基酸序列；所述CDR
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L1、所述CDR
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H2以及所述CDR
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包含SEQ ID NO:37
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42的氨基酸序列；所述CDR
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L2、所述CDR
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L3、所述CDR
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‑
H3分别包含SEQ ID NO:43
‑
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L1、所述CDR
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H1、所述CDR
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H2以及所述CDR
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H3分别包含SEQ ID NO:49
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54的氨基酸序列；所述CDR
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‑
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L2、所述CDR
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L3、所述CDR
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H2以及所述CDR
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66的氨基酸序列；所述CDR
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L1、所述CDR
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L2、所述CDR
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L3、所述CDR
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H1、所述CDR
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H2以及所述CDR
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L2、所述CDR
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L3、所述CDR
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H1、所述CDR
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H2以及所述CDR
‑
H3分别包含SEQ ID NO:73
‑
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H1、所述CDR
‑
H2以及所述CDR
‑
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‑
84的氨基酸序列；所述CDR
‑
L1、所述CDR
‑
L2、所述CDR
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L3、所述CDR
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L1、所述CDR
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L2、所述CDR
‑
L3、所述CDR
‑
H1、所述CDR
‑
H2以及所述CDR
‑
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‑
96的氨基酸序列；所述CDR
‑
L1、所述CDR
‑
L2、所述CDR
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L3、所述CDR
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H1、所述CDR
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H2以及所述CDR
‑
H3分别包含SEQ ID NO:97
‑
102的氨基酸序列；所述CDR
‑
L1、所述CDR
‑
L2、所述CDR
‑
L3、所述CDR
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H1、所述CDR
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‑
108的氨基酸序列；所述CDR
‑
L1、所述CDR
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L2、所述CDR
‑
L3、所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨安绥，余忠铭，陈英谦，董昭萍，彭洪斌，
申请(专利权)人：刘扶东，
类型：发明
国别省市：