【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】淋巴细胞克隆性确定
[0001]本专利技术的实施方案总体上涉及淋巴细胞克隆性，特别是确定淋巴细胞克隆性。
技术介绍
[0002]T淋巴细胞和B淋巴细胞在激活后经历克隆扩增。克隆性的监测在血液疾病的诊断和随访中非常重要，并且是了解免疫学应用(包括感染、癌症和自身免疫)中的抗原特异性的基本工具。如今，使用下一代测序(NGS)方法对克隆性进行全面评估是可行的。在临床上，需要改进的方法学特异性和灵敏度来确定免疫组库，例如，以检测急性淋巴细胞白血病和监测微小残留病。此外，在免疫病症(诸如自身免疫和肿瘤免疫)的研究中，改进的免疫组库分析将有利于鉴定相关免疫细胞，用于评价免疫调节药物的效率，以及探索其作用方式。
[0003]T细胞包含T细胞受体(TCR)，所述受体可以由两个亚基α和β或γ和δ构成。这些亚基由被称为可变(V)区和连接(J)区的不同遗传区域组成，一些亚基还包括一个或两个多样性(D)区域。在免疫细胞成熟期间，区域在DNA水平上以可变、多样性、连接的顺序随机重组，并且在每个区段之间发生随机的核苷酸添加和/或缺失，从而为每个细胞构建高度多样化和唯一的序列。重组序列编码具有唯一抗原特异性的TCR，并且在细胞克隆扩增时遗传。这在研究免疫防御动力学和其他生物学应用时是令人感兴趣的。
[0004]对应地，B细胞包含由形成1型跨膜受体蛋白的免疫球蛋白分子组成的B细胞受体(BCR)。BCR由被称为膜免疫球蛋白(mIg)的抗原结合亚基组成，所述亚基由两条免疫球蛋白轻链(IgL)和两条免疫球蛋白重链(IgH)以及Ig>‑
α和Ig
‑
β的两个异二聚体亚基组成。在BCR中，识别抗原的部分由类似于T细胞的TCR的不同的V、D和J遗传区域组成。
[0005]使用NGS研究免疫组库有两种主要不同的方法，即靶向扩增DNA中的第三个互补决定区(CDR3)或靶向扩增转录的mRNA。使用这些基于NGS的标准方法分析细胞克隆性时的挑战是，由于扩增不均匀，无法确定克隆的确切数量和尺寸。此外，不能可靠地区分具有相似序列的克隆型和PCR和测序期间引入的序列错误。已经开发了若干种方法来克服这些限制，包括使用合成的加标分子来校正定量偏差和生物信息学方法来减少PCR诱导的错误。
[0006]美国专利号9,394,567公开了用于检测和定量含有T细胞和/或B细胞的个体的组织样品中的核酸污染的方法，所述方法用于生成基于序列的克隆型谱。所述方法通过测量内源性或外源性核酸标签的存在和/或水平来实施，通过所述标签可以区分来自预期个体的核酸与来自非预期个体的核酸。内源性标签包括遗传同一性标志物，诸如短串联重复、稀有克隆型等，而外源性标签包括用于从序列读段中确定克隆型序列的序列标签。
[0007]美国专利号9,506,119公开了使用序列标签来改进相关序列的扩增子的序列确定。对具有相同序列标签的序列读段进行比对，然后根据每个位置处的序列读段碱基调用(base call)的平均碱基调用确定最终碱基调用。类似地，包含一系列掺入信号的序列读段通过共同的序列标签进行比对，并且均聚物区域中的碱基调用作为每个“流动”位置处的功能掺入信号值进行。
技术实现思路
[0008]总体目标是提供一种用于确定淋巴细胞克隆性的方法。
[0009]具体目标是提供一种能够鉴定和定量样品中的TCR和BCR克隆型的方法。
[0010]这些目标和其他目标通过如本文所公开的实施方案来满足。
[0011]本专利技术在独立权利要求中进行限定。其它实施方案在从属权利要求中进行限定。
[0012]本专利技术的一个方面涉及确定淋巴细胞克隆性的方法。所述方法包括使包含淋巴细胞的核酸分子的样品与M个正向引物和N个反向引物接触。M是等于或大于1的整数，并且N是等于或大于1的整数。M个正向引物从5'端到3'端包含接头序列和靶特异性序列。N个反向引物从5'端到3'端包含接头序列和靶特异性序列。M个正向引物是M个发夹条形码正向引物，且/或N个反向引物是N个发夹条形码反向引物。每个发夹条形码正向引物从5'端到3'端包含5'茎序列、接头序列、唯一分子标识符(UMI)、3'茎序列和与T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)克隆型的相应部分互补的靶特异性序列。每个发夹条形码反向引物从5'端到3'端包含5'茎序列、接头序列、UMI、3'茎序列和与TCR或BCR克隆型的相应部分互补的靶特异性序列。发夹条形码正向引物和/或发夹条形码反向引物的5'茎序列的至少一部分与发夹条形码正向引物和/或发夹条形码反向引物的3'茎序列的至少一部分互补。5'茎序列和3'茎序列被配置为在封闭退火温度或低于封闭退火温度下彼此杂交，而在开放退火温度或高于开放退火温度下彼此不杂交。所述方法还包括通过执行核酸分子的聚合酶链式反应(PCR)预扩增来扩增核酸分子以形成多个带条形码的PCR产物。PCR预扩增的退火温度等于或低于发夹条形码正向引物和/或发夹条形码反向引物的封闭退火温度。所述方法还包括使多个带条形码的PCR产物与接头特异性正向引物和接头特异性反向引物接触，并且通过对带条形码的PCR产物执行PCR扩增来扩增带条形码的PCR产物，以形成扩增的带条形码的PCR产物文库。PCR扩增的循环的至少一部分的退火温度等于或大于发夹条形码正向引物和/或发夹条形码反向引物的开放退火温度。方法还包括对扩增的带条形码的PCR产物的至少相应部分进行测序，以形成包含UMI和TCR序列或BCR序列的相应序列读段。方法还包括基于UMI的核酸序列来多路解编序列读段，并且基于TCR或BCR序列的核酸序列将多路解编的序列读段绘制成相应的TCR或BCR克隆型。然后基于多路解编和绘制的序列读段确定样品的淋巴细胞克隆性。
[0013]本专利技术的另一个方面涉及疾病表征的方法。所述方法包括根据上文确定样品的淋巴细胞克隆性，所述样品包含从受试者获得的淋巴细胞的核酸分子。所述方法还包括基于确定的淋巴细胞克隆性表征受试者的疾病。在一个实施方案中，疾病选自由血液疾病、感染性疾病、癌症疾病和自身免疫疾病组成的组。
[0014]本专利技术提供了一种非常灵敏的淋巴细胞克隆性确定，其解决了TCR和/或BCR克隆型的不均匀扩增和测序期间聚合酶诱导的错误的问题。本专利技术可以应用于各种样品类型，包括富集和非富集细胞群。该方法操作简单，不需要任何靶核酸分子捕获，并且提供TCR和/或BCR克隆型的定量信息。
附图说明
[0015]通过结合附图参考以下描述，可以最好地理解实施方案及其进一步的目的和优点，其中：
[0016]图1.示出了根据一个实施方案确定淋巴细胞克隆性的方法的流程图。
[0017]图2.根据一个实施方案在确定淋巴细胞克隆性的方法中使用的引物(A、B、C)和扩增步骤(A)的示意图。
[0018]图3.δTCR组库测序的图解说明。(A)未重排TCRδ(TRD)基因座的示意图，箭头示出了转录方向。TRD可变4(TRDV4)至TRDV8在TCRα(TRA)和TRD基因座之间共享(参见表1)。(B)扩增由两轮PCR组成。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种确定淋巴细胞克隆性的方法，所述方法包括：使包含淋巴细胞的核酸分子(1)的样品与M个正向引物(10)和N个反向引物(20)接触(S1)，其中M是等于或大于1的整数，并且N是等于或大于1的整数；所述M个正向引物(10)从5'端(11)到3'端(17)包含接头序列(13)和靶特异性序列(16)；所述N个反向引物(20)从5'端(21)到3'端(27)包含接头序列(23)和靶特异性序列(26)；所述M个正向引物(10)是M个发夹条形码正向引物(10)，且/或所述N个反向引物(20)是N个发夹条形码反向引物(20)；每个发夹条形码正向引物(10)从5'端(11)到3'端(17)包含5'茎序列(12)、接头序列(13)、唯一分子标识符(UMI)(14)、3'茎序列(15)和与T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)克隆型的相应部分(2)互补的靶特异性序列(16)；每个发夹条形码反向引物(20)从5'端(21)到3'端(27)包含5'茎序列(22)、接头序列(23)、UMI(24)、3'茎序列(25)和与TCR或BCR克隆型的相应部分(3)互补的靶特异性序列(26)；并且所述发夹条形码正向引物(10)和/或所述发夹条形码反向引物(20)的所述5'茎序列(12,22)的至少一部分与所述发夹条形码正向引物(10)和/或所述发夹条形码反向引物(20)的所述3'茎序列(15,25)的至少一部分互补，所述5'茎序列(12,22)和所述3'茎序列(15,25)被配置为在封闭退火温度或低于封闭退火温度下彼此杂交，并且在开放退火温度或高于开放退火温度下不彼此杂交；通过执行所述核酸分子(1)的聚合酶链式反应(PCR)预扩增来扩增(S2)所述核酸分子(1)，以形成多个带条形码的PCR产物(50)，其中所述PCR预扩增的退火温度等于或低于所述发夹条形码正向引物(10)和/或所述发夹条形码反向引物(20)的所述封闭退火温度；使所述多个带条形码的PCR产物(50)与接头特异性正向引物(30)和接头特异性反向引物(40)接触(S3)；通过对所述带条形码的PCR产物(50)执行PCR扩增来扩增(S4)所述带条形码的PCR产物(50)，以形成扩增的带条形码的PCR产物(60)的文库，其中所述PCR扩增的循环的至少一部分的退火温度等于或大于所述发夹条形码正向引物(10)和/或所述发夹条形码反向引物(20)的所述开放退火温度；对所述扩增的带条形码的PCR产物(60)的至少相应部分进行测序(S5)，以形成包含所述UMI(64)和TCR或BCR序列(66)的相应序列读段；基于所述UMI(64)的核酸序列来多路解编(S6)所述序列读段；基于所述TCR或BCR序列(66)的核酸序列，将所述多路解编的序列读段绘制(S7)成相应的TCR或BCR克隆型；以及基于所述多路解编和绘制的序列读段确定(S8)所述样品的淋巴细胞克隆性。2.根据权利要求1所述的方法，其中扩增(S2)所述核酸分子(1)包括通过执行所述核酸分子(1)的PCR预扩增的1
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25个循环、优选2
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20个循环、更优选2
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15个循环来扩增(S2)所述核酸分子(1)，以形成所述多个带条形码的PCR产物(50)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中扩增(S4)所述带条形码的PCR产物(50)包括通过对所述带条形码的PCR产物(50)执行PCR扩增的至少2个循环、优选至少3个循环、更优选至少5个循环来扩增(S4)所述带条形码的PCR产物(50)，以形成扩增的带条形码的PCR产物(60)的文库。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中多路解编(S6)所述序列读段包括将所述序列读段分成具有所述UMI(64)的相同核苷酸序列的组，任选地在同一组中具有UMI(64)的核苷酸序列允许的至多预定数量的错配。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中绘制(S7)所述多路解编的序列读段包括将所述多路解编的序列读段分成具有TCR或BCR序列(66)的相同核苷酸序列的组，任选地在同一组中具有TCR或BCR序列(66)的核苷酸序列允许的至多预定数量的错配。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中确定(S8)淋巴细胞克隆性包括基于所述多路解编和绘制的序列读段对所述样品中存在的所述TCR或BCR克隆型进行定量。7.根据...
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