用于操纵微滴的设备和方法的改进技术

提供了一种在微滴测定系统中通过将贴壁细胞与微珠缀合来处理贴壁细胞的方法。所述方法50包括以下步骤：将第一多个微滴加载到微流体空间中，其中第一微滴中的每一个含有微珠52和第一流体；将第二多个微滴加载到微流体空间中，其中第二微滴中的每一个含有贴壁细胞和第二流体54；将第一多个微滴和第二多个微滴合并以形成多个合并微滴56，每个合并微滴含有第一流体和第二流体、至少一个微珠以及至少一个贴壁细胞；以及搅动合并微滴中的每一个58以使合并微滴中的每一个中的第一流体和第二流体移动，使得至少一个贴壁细胞粘附到至少一个微珠上。上。上。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于操纵微滴的设备和方法的改进
[0001]本专利技术涉及用于操纵微滴的方法和系统，并且特别地涉及在微滴测定系统中处理细胞的方法和系统。本专利技术还涉及一种在微滴测定系统中通过将贴壁细胞与微珠缀合来处理贴壁细胞的方法。
[0002]源自人类和/或动物组织的细胞可以在培养中进行操纵，以用作研究开发工具，特别是用于生产病毒载体和疫苗以及各种治疗性蛋白质，以便产生用于筛选药物的功能性细胞或组织类似物。
[0003]哺乳动物细胞可以通过病毒感染而使其生产药物，并且通过基因工程而使其生产治疗性蛋白质。对于缺乏正常形式的蛋白质或不能以足够数量产生该蛋白质的患者来说，这些药物中的许多是必需的。
[0004]这样的细胞生长需要一个复杂的环境，其含有营养物的混合物，包括糖、氨基酸、维生素、矿物质以及生长因子诸如胰岛素和各种细胞因子。此外，除了血流或淋巴系统中天然的某些细胞类型以外，源自组织的细胞是贴壁依赖性的，这意味着它们不会作为自由漂浮的单个细胞生长。因此，在从组织环境中释放后，细胞需要它们可以粘附于其上的表面，否则它们将无法生存和分裂。
[0005]在常规微流体内部培养贴壁细胞的方法是已知的，例如，在芯片上器官应用中。特别地，存在现有的试图培养贴壁细胞的基于板的工作流程。这样的微流体系统可以包括连续流动的微流体，其中流体流由微结构化通道输送和控制。其还可以包括数字微流体，其中离散体积的流体被单独操纵。一类数字微流体包括“介质上电润湿”(ElectroWetting On Dielectric，EWOD)装置，以及光学EWOD装置的子类，诸如在WO2018/234445中公开的那些(该文献通过引用并入)。这样的装置允许细胞培养基的液滴(任选地被油基载体相包围)在微流体芯片周围受控移动。然而，为了在这样的平台上实现贴壁细胞生长，需要在芯片装置上在液滴内容物和某种培养区域之间可控地引入接触，这在任何常规液滴处理微流体平台中实现起来都是复杂的。
[0006]在数字微流体上培养贴壁细胞的公开内容有限。例如，先前的公开内容已经描述了在具有电极阵列的芯片上实验室平台中使用常规电润湿来实施哺乳动物细胞培养。然而，由于用于致动的固定电极的大尺寸，这样的平台在它们可以同时操纵的细胞数量方面受到限制。出于同样的原因，这样的平台通常不适于操纵封装在亚纳升体积中的单个细胞。此外，在固定的电极位置和尺寸的情况下，这样的系统的灵活性和适应性受到限制。
[0007]在其他开发中，细胞粘附到由微珠载体形成的固体支持物上是众所周知的，并且常规地用于放大的生物生产，其中微珠为细胞粘附提供增加的表面积。然而，使用常规液滴平台将固体微珠与贴壁细胞结合具有挑战性，尤其是在单细胞水平上工作。不可能在控制的情况下平行地执行大数量的液滴合并，使得每个细胞都暴露于精确数量的珠。在培养贴壁细胞系时，能够控制每个细胞所暴露的珠的精确数量是重要的，因为贴壁细胞的生长依赖于粘附支持物上的可用表面积。因此，必须精确控制粘附到每个微珠上的细胞数量，以获得最佳的贴壁细胞培养。由于受限的气体供应，其中液滴在通道中温育或储存的仪器具有很差的细胞活力水平。
[0008]对于许多重要的测定，在对贴壁细胞的表型性状进行筛选之后，必须将它们从微流体系统中回收。在一些测定中，这是为了进行基因分析，其可以包括DNA测序、RNA测序或PCR检测。在一些测定中，这种回收是为了从回收的材料中扩增细胞的集落，这包括其中从单个回收的细胞中扩增克隆集落的情形。当贴壁细胞需要生长成集落时，它们必须在回收后进入贴壁状态。在其中贴壁细胞在芯片上生长并且回收以进行扩增的任何其他微流体系统中，它们必须暂时回到悬浮状态以运输出芯片，然后返回到贴壁状态以在微孔板或烧瓶中生长。每次细胞经历贴壁状态和悬浮状态之间时，该过程都会对细胞诱导应力，降低细胞活力，并且改变细胞的表达谱。因此，回收和相关再悬浮过程是微流体细胞培养系统的已知缺陷，并且具有其中可以将细胞以其贴壁状态从微流体系统中回收的系统是高度有利的。
[0009]因此，需要提供一种用于以有效、快速和成本有效的方式将贴壁细胞附着、生长和/或分配到珠(诸如微珠)上的方法和设备。所述方法和设备应在液滴合并步骤期间保持足够的控制，使得每个贴壁细胞暴露于精确数量的珠，即使当大数量的液滴并行地合并时也是如此。通过提供一种用于控制贴壁细胞与微珠的附着和从微珠的脱离的有效方法，其可以促进细胞的附着和增殖，从而能够在高通量环境中实现靶细胞的受控生长。
[0010]本专利技术就是在此背景下产生的。
[0011]根据本专利技术的一个方面，提供了一种在微滴测定系统中通过将贴壁细胞与微珠缀合来处理贴壁细胞的方法，所述方法包括：将第一多个微滴加载到微流体空间中，其中第一微滴中的每一个含有微珠和第一流体；将第二多个微滴加载到微流体空间中，其中第二微滴中的每一个含有贴壁细胞和第二流体；将第一多个微滴和第二多个微滴合并以形成多个合并微滴，每个合并微滴含有第一流体和第二流体、至少一个微珠以及至少一个贴壁细胞；以及搅动合并微滴中的每一个以使合并微滴中的每一个中的第一流体和第二流体移动，使得至少一个贴壁细胞粘附到至少一个微珠上。
[0012]在一些实施方案中，提供了一种在微滴测定系统中通过将贴壁细胞与微珠缀合来处理贴壁细胞的方法，所述方法包括：将含有微珠和第一流体的第一多个微滴以及含有贴壁细胞和第二流体的第二多个微滴加载到微流体空间中；将第一多个微滴和第二多个微滴合并以形成多个合并微滴，每个合并微滴含有第一流体和第二流体、至少一个微珠以及至少一个贴壁细胞；以及搅动合并微滴以使第一流体和第二流体移动，使得至少一个贴壁细胞粘附到至少一个微珠上。
[0013]贴壁细胞可以在培养之前暂时保持为悬浮状态。
[0014]任选地，从微流体空间中喷射合并微滴并且将它们分配到经处理的微孔板上，在那里使细胞附着至板并且增殖。
[0015]本专利技术中公开的方法是有利的，因为它提供了一种用于控制和促进贴壁细胞与微珠的附着和从微珠的脱离的有效且可放大的方法。因此，本专利技术的方法允许使用者可靠地控制和/或操纵靶细胞(诸如哺乳动物细胞)的生长。
[0016]如在本专利技术的上下文中使用的，术语“贴壁细胞”应理解为包括在培养期间为了细胞活力而需要支持结构的任何细胞系。其他类型的细胞可以悬浮地自由生长，并且不需要用于生长和增殖的固体支持物。贴壁细胞是贴壁依赖性的并且需要粘附到固体支持物上以进行生长。贴壁细胞可以适应悬浮生长。然而，这需要将贴壁细胞转变为悬浮状态，其会降低细胞活力。因此，术语“贴壁细胞”应理解为与不需要粘附到固体支持物上(为了细胞活
力)但是由于其他原因(诸如用作测定报告物)而可以附着至支持物的细胞系不同。贴壁细胞的实例包括但不限于哺乳动物组织细胞诸如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、生产细胞系、上皮细胞和某些类型的癌细胞。
[0017]另外，将贴壁细胞粘附到至少一个微珠上是高度期望的，因为微珠可以为贴壁细胞粘附提供增加的表面积，这对于贴壁细胞的放大生物生产是特别有用的。
[0018]此外，微本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在微滴测定系统中通过将贴壁细胞与微珠缀合来处理贴壁细胞的方法，所述方法包括：将第一多个微滴加载到微流体空间中，其中所述第一微滴中的每一个含有微珠和第一流体；将第二多个微滴加载到所述微流体空间中，其中所述第二微滴中的每一个含有贴壁细胞和第二流体；将所述第一多个微滴和所述第二多个微滴合并以形成多个合并微滴，每个合并微滴含有所述第一流体和所述第二流体、至少一个微珠以及至少一个贴壁细胞；和搅动所述合并微滴中的每一个以使所述合并微滴中的每一个中的所述第一流体和所述第二流体移动，使得至少一个贴壁细胞粘附到至少一个微珠上。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括以下步骤：对粘附到所述至少一个微珠上的所述至少一个贴壁细胞进行选择、测定、培养或回收过程。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微流体空间是微流体芯片的一部分，所述微流体芯片被配置为经由光学介导的电润湿(oEWOD)来操纵所述第一多个微滴和所述第二多个微滴。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微珠具有被配置为有利于细胞粘附的多肽的表面功能化。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述肽表面功能化包括以下序列中的一个或多个：Gly
‑
Arg
‑
Gly
‑
Asp
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Ser(GRGDS)、Arg
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Gly
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Asp(RGD)或Gly
‑
Arg
‑
Gly
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Asp
‑
Ser
‑
Pro(GRGDSP)。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述贴壁细胞处于其天然贴壁状态。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：在合并之前，检查所述第一多个微滴和所述第二多个微滴的至少一个子集以确定所述微滴的内容物以及每个微滴的珠或细胞的数...

【专利技术属性】
技术研发人员：马切伊，
申请(专利权)人：光投发现有限公司，
类型：发明
国别省市：