一种Apaf1基因敲除HEK293细胞系及构建方法和应用技术

本发明专利技术公开一种Apaf1基因敲除HEK293细胞系及构建方法和应用，属于分子生物学技术领域。采用CRISPR/Cas9技术对HEK293细胞中的Apaf1基因进行敲除，得到Apaf1基因敲除的HEK293细胞系。经验证，在Apaf1基因敲除的HEK293E细胞中，瞬时或稳定表达重组蛋白，与正常HEK293E细胞相比，Apaf1基因敲除的HEK293E细胞中的重组蛋白表达水平显著升高。本发明专利技术提供的Apaf1基因敲除的HEK293E细胞有望成为重组蛋白高效表达与生产的宿主细胞，也为重组蛋白高效表达提供了一种新的解决方案。白高效表达提供了一种新的解决方案。白高效表达提供了一种新的解决方案。

【技术实现步骤摘要】
一种Apaf1基因敲除HEK293细胞系及构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种Apaf1基因敲除HEK293细胞系及构建方法和应用，属于分子生物学


技术介绍

[0002]重组蛋白药物是指应用重组DNA或RNA技术获得的治疗性的蛋白质，在目前生物制药领域占据重要地位。目前在工业生产中，哺乳动物细胞是重组蛋白类药物最常用的表达系统之一，中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞是目前重组蛋白质生产的首选宿主细胞，用于治疗的重组蛋白药物约70％是由CHO细胞制备，但在CHO细胞中生产重组蛋白的一个缺点是缺乏正确的翻译后糖基化修饰功能，这会促使重组蛋白在人体内具有免疫原性。而HEK293细胞作为人源细胞种系，具有精确的糖基化模式，消除了免疫原性的可能性，可作为重组蛋白生产的替代宿主。但是随着人们的需求量增加，进一步提高重组蛋白药物产量、降低生产成本成为亟待解决的问题。
[0003]目前，提高重组蛋白药物产量的措施涉及重组蛋白载体优化，细胞系建立以及培养基及生产工艺等的改进。伴随着基因工程尤其是基因编辑技术的进步，改造细胞系这一手段在提高重组蛋白产量上被越来越广泛的应用。
[0004]在众多的研究中，我们注意到抑制细胞凋亡途径在提高重组蛋白产量上具有极大潜力，通过抑制细胞凋亡途径，可以减缓细胞凋亡，增加细胞数量，从而提高重组蛋白产量。其中Apaf1(凋亡酶激活因子，apoptotic protease activating factor
‑
1)是一种分子量为130kDa的蛋白质，在依赖线粒体凋亡途径中发挥着重要作用。它包括一个N
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末端的CARD结构域，接着是一个与CED
‑
4高度同源的区域和一个包含多个WD
‑
40重复序列的C
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末端结构域，它在细胞色素c和dATP存在的情况下寡聚形成一个非常大的(～700
‑
1400kDa)的凋亡体复合体，该复合体与Procaspase
‑
9结合并催化其活性，激活的Procaspase
‑
9通过级联反应激活下游成分，促进细胞凋亡。因此，通过抑制Apaf1减缓细胞凋亡途径，进而延长宿主细胞表达时限，使提高重组蛋白生产成为可能。目前，Apaf1基因敲除的HEK293细胞系及其在重组蛋白表达方面未见报道。

技术实现思路

[0005]为了弥补现有技术中的不足，本专利技术的第一个目的是提供一种Apaf1基因敲除HEK293细胞系，从基因和蛋白水平的检测都证实，Apaf1基因已被成功敲除。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供的Apaf1基因敲除HEK293细胞系构建方法，该方法基于CRISPR/Cas9技术，可以简单、高效的实现HEK293细胞中Apaf1基因的敲除。与沉默、敲低、干扰等方法相比，敲除效果更加彻底，适于对Apaf1基因缺失的HEK293细胞进行更加深入的研究。
[0007]本专利技术的第三个目的是提供Apaf1基因敲除HEK293细胞系在重组蛋白生产中的应用。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0009]一种Apaf1基因敲除HEK293细胞系，对HEK293细胞中的Apaf1基因进行敲除，得到Apaf1基因敲除的HEK293细胞系。
[0010]本专利技术提供的Apaf1基因敲除HEK293细胞系，与正常的HEK293细胞系相比，凋亡水平受到抑制，增殖较为明显。使用Apaf1基因敲除HEK293细胞瞬时或稳定表达重组蛋白，与正常HEK293细胞相比，重组蛋白表达量显著提高。
[0011]优选地，所述敲除为利用CRISPR/Cas9技术实现。
[0012]CRISPR/Cas9技术相对于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应分子(TALEN)，具有更高效、快速、简便、廉价的优点，利用CRISPR/Cas9技术可以快速、高效、低成本地完成HEK293细胞中Apaf1基因的敲除。
[0013]优选地，所述HEK293细胞为HEK293E细胞。
[0014]HEK293E细胞转染效率高，易于sgRNA的转染，且易于培养，便于后期单克隆细胞的获得。
[0015]一种Apaf1基因敲除HEK293细胞系构建方法，包括以下步骤：根据人Apaf1基因序列设计sgRNA，将其分别插入到表达载体中构建sgRNA表达载体；sgRNA表达载体转染HEK293细胞，经嘌呤霉素筛选、细胞单克隆化处理、鉴定后获得敲除Apaf1基因的HEK293细胞系。
[0016]本专利技术提供的Apaf1基因敲除HEK293细胞系构建方法，能快速高效的实现HEK293细胞中Apaf1基因的敲除，且便于操作，成本较低。
[0017]优选地，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO1～3所示。
[0018]本专利技术依据人Apaf1基因中5个转录本的共有外显子序列进行sgRNA的设计，上述三个sgRNA序列可对Apaf1基因进行高效敲除。
[0019]优选地，所述sgRNA的敲除靶点位于Apaf1基因第三外显子上；所述Apaf1基因第三外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示。
[0020]优选地，所述嘌呤霉素的浓度为1.0～1.5μg/ml。
[0021]使用此浓度范围的嘌呤霉素对转染sgRNA表达载体的HEK293细胞进行筛选，可以在保证转染成功的HEK293细胞存活的同时，杀死没有成功转染的HEK293细胞，且细胞的生长状态没有影响。
[0022]Apaf1基因敲除HEK293细胞系在重组蛋白生产中的应用。
[0023]与正常HEK293细胞相比，在Apaf1基因敲除HEK293细胞中瞬时或稳定表达重组蛋白，重组蛋白的表达量显著升高。Apaf1基因敲除HEK293细胞有望为重组蛋白的高效表达与生产提供一种有前景的宿主细胞。
附图说明
[0024]图1为本专利技术实施例1中sgRNA表达载体图；
[0025]图2为本专利技术实施例1中sgRNA表达载体转染效率荧光图(40倍)；
[0026]图3为本专利技术实施例1中有限稀释法获得Apaf1基因敲除HEK293单克隆细胞荧光图(100倍)；
[0027]图4为本专利技术实施例1中获得Apaf1基因敲除HEK293单克隆细基因测序结果；
[0028]图5为本专利技术实施例1中敲除细胞系Apaf1的mRNA表达水平、蛋白表达水平检测结
果；
[0029]图6为本专利技术实施例1中敲除细胞系悬浮培养7天的细胞计数结果；
[0030]图7为本专利技术实施例2中本专利技术中SEAP蛋白检测结果；
[0031]图8为本专利技术实施例2中本专利技术中VN蛋白的Western Blot表达水平检测结果(M为Marker)。
具体实施方式
[0032]下面结合具体附图和实施例对本专利技术进行详细、明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Apaf1基因敲除HEK293细胞系，其特征在于：对HEK293细胞中的Apaf1基因进行敲除，得到Apaf1基因敲除的HEK293细胞系。2.根据权利要求1所述的Apaf1基因敲除HEK293细胞系，其特征在于：所述敲除为利用CRISPR/Cas9技术实现。3.根据权利要求1所述的Apaf1基因敲除HEK293细胞系，其特征在于：所述HEK293细胞为HEK293E细胞。4.一种如权利要求1所述的Apaf1基因敲除HEK293细胞系构建方法，其特征在于：包括以下步骤：根据人Apaf1基因序列设计sgRNA，将其分别插入到表达载体中构建sgRNA表达载体；sgRNA表达载体转染HEK293细胞，经嘌呤霉素筛选、细胞单克...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊河，王天云，肖云喜，牛敬媛，徐红彦，马静，贾岩龙，王小引，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：