一种视网膜分化潜能细胞系CRX-Shen001及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种视网膜分化潜能细胞系CRX

【技术实现步骤摘要】
一种视网膜分化潜能细胞系CRX
‑
Shen001及其构建方法


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种具有人视网膜分化潜能的红色荧光标记细胞系及其构建方法。

技术介绍

[0002]视网膜退行性疾病包括遗传性视网膜变性、年龄相关性黄斑变性等。光感受器功能障碍和丧失是视网膜退行性疾病的主要原因之一。由于人类视网膜中的光感受器不可再生，视网膜退行性疾病会导致视杆和视锥细胞的永久性丧失。
[0003]目前临床上尚无针对视网膜退行性疾病的有效治疗方法。尤其是，视网膜退行性疾病的晚期阶段，在光感受器细胞已经大量丧失的情况下，目前的研究热点基因治疗和基因编辑方法均不适用。以恢复视网膜光敏性为目的的替代策略正处于探索阶段，包括光遗传工具、光感受器移植等。
[0004]光感受器移植是指将供体光感受器细胞移植到视网膜下腔从而补充替换已丧失的光感受器细胞，可以替代晚期视网膜变性中丢失的细胞，是一种很有前途的再生策略。影响其治疗效果的其中一个重要因素就是供体细胞的来源，确定合适的供体细胞类型和来源是至关重要的。
[0005]供体细胞由原代细胞或组织，发展到通过2D培养系统获得可移植的光感受器前体细胞，最终发展到今日通过3D培养技术获得视网膜类器官作为供体细胞来源。
[0006]光感受器的发育和维持需要精确调控的基因表达，这种调节是由以CRX为中心的光感受器转录因子网络介导的，CRX是一种同源结构域转录因子。CRX是光感受器前体细胞的分子标志物，其可以作为筛选适合移植的光感受器前体细胞的途径，TdTomato是一种信号非常强的红色荧光蛋白，其对细胞和小鼠没有明显的毒性，是非常理想的细胞成像工具。因此，将TdTomato转入到干细胞染色体上的组织特异性的CRX基因末端，可以得到能够在分化成视网膜类器官时表达红色荧光的干细胞。
[0007]CRISPR/Cas是原核生物的一种免疫系统，最早于1987年被发现，随后，CRISPR/Cas系统被运用成一种高效的基因编辑工具，成为第三代基因组定点编辑技术。2013年时，研究人员成功地使用CRISPR/Cas系统编辑了哺乳动物细胞的基因组。由于其应用成本低，操作方便，效率高，一经出现便成为基因组定点编辑的热门技术。但是，CRISPR/Cas系统介导的基因编辑得到的转基因细胞并非具有统一的性状，不同的实验批次，甚至同一批次的不同克隆，都有可能得到差异极大的结果。因此，需要在基因编辑后进行进一步的筛选，才能得到更符合研究需求的转基因细胞。

技术实现思路

[0008]专利技术所要解决的技术问题是提供一种构建具有人视网膜分化潜能的红色荧光标记细胞系的方法，包括将红色荧光蛋白表达框插入到人干细胞基因组中的步骤。
[0009]在一个具体实施方案中，所述红色荧光蛋白为tdTomato。
[0010]在一个具体实施方案中，所述人干细胞为H9细胞。
[0011]在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0012]S1：构建打靶载体，所述打靶载体包含所述红色荧光蛋白表达框和筛选用的抗性基因；
[0013]S2：通过CRISPR/Cas9基因编辑系统将所述打靶载体插入到hES
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ZLM
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001的第四外显子的终止密码子前；
[0014]S3：消除所述抗性基因。
[0015]在一个具体实施方案中，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统中sgRNA的左侧向导序列为SEQ ID NO:1
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3中的一个，右侧向导序列为SEQ ID NO:4
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6中的一个。
[0016]在一个具体实施方案中，通过在所述打靶载体中搭载CreERT2系统来消除所述抗性基因。
[0017]本专利技术还提供了上述方法构建得到的具有人视网膜分化潜能的红色荧光标记细胞系。
[0018]本专利技术还提供了一种具有人视网膜分化潜能的红色荧光标记细胞，于2022年1月25日将CRX
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Shen001保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号CCTCC NO:C202207。
[0019]本专利技术通过设计打靶载体和相关的分子遗传操作，并通过筛选构建了一种红色荧光标记的胚胎干细胞系,该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜。该细胞系是一种强大的工具，可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究,并促进致盲疾病治疗方法的开发。
[0020]生物材料保藏
[0021]本专利技术的一个细胞系在2022年1月25日将CRX
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Shen001保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号CCTCC NO:C202207，命名为人源胚胎干细胞CRX
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Shen001。
附图说明
[0022]图1为CRISPR/Cas9介导CRX
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tdTomato
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iCreERT2人胚胎干细胞系构建流程图。
[0023]图2为sgRNA引物活性检测统计图。
[0024]图3为打靶载体质粒图。
[0025]图4为打靶载体酶切后的电泳照片。
[0026]图5为各细胞系流式细胞分析，其中A组为A07细胞系的流式图，B组为CRX
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Shen001细胞系的流式图。
[0027]图6为胚胎干细胞培养及诱导分化流程。
[0028]图7为A07细胞系(右)和CRX
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Shen001细胞系(左)分化60天后得到的视网膜类器官的荧光显微照片。
具体实施方式
[0029]以下结合附图对专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释专利技术，并非用
于限定专利技术的范围。
[0030]1、CRISPR/Cas9介导红色荧光报告人胚胎干细胞系的构建
[0031]对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，确认其是否与Genebank DNA序列数据库和Ensembl基因组数据库中所给序列一致。如图1所示，在hES
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ZLM
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001基因Exon4和3
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UTR之间终止密码子前插入P2A
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tdTomato
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P2A
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iCreERT2，利用CRISPR/Cas9技术制备hES
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ZLM
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001敲进H9细胞系。
[0032]基于sgRNA的设计原则，在靶位点区域共设计多条sgRNA，并检测sgRNA活性。
[0033]将293T细胞铺种96孔板,37℃，5％ CO2环境下培养，待密度为80％
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90％时进行转染实验。通过Lipof本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建具有人视网膜分化潜能的红色荧光标记细胞系的方法，其特征在于，包括将红色荧光蛋白表达框插入到人干细胞基因组中的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红色荧光蛋白为tdTomato。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人干细胞为H9细胞。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：构建打靶载体，所述打靶载体包含所述红色荧光蛋白表达框和筛选用的抗性基因；S2：通过CRISPR/Cas9基因编辑系统将所述打靶载体插入到hES
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ZLM
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001的第四外显子的终止密码子前；S3：消除所述抗性基因。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CRI...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈吟，
申请(专利权)人：中眸医疗科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：