溶瘤单纯疱疹病毒VP5蛋白与人白细胞抗原E的互作方法及应用技术

本申请公开涉及人白细胞抗原E与溶瘤单纯疱疹病毒主要衣壳蛋白VP5相互作用研究，通过GST pull down的方法验证UL19表达的VP5与HLA

【技术实现步骤摘要】
溶瘤单纯疱疹病毒VP5蛋白与人白细胞抗原E的互作方法及应用


[0001]该专利技术专利申请涉及生物技术，具体溶瘤单纯疱疹病毒VP5蛋白与人白细胞抗原E的互作方法及应用，据此可以筛查疾病、减少肿瘤细胞、也可相应构建点突变动物模型用于医学研究。

技术介绍

[0002]溶瘤病毒进入靶细胞后，利用病毒的复制能力，可以破坏靶细胞。当溶瘤病毒病毒基因组传递到易感的靶细胞中，通过篡改细胞的生物合成机制以制造后代病毒。这些后代病毒会传播到相邻细胞中，从而导致组织被破坏的特征性模式。这会激发先天性和适应性免疫反应(细胞和体液)，从而抵抗感染并保护宿主免于将来再暴露于同一病毒。从一个药理学的角度来看，病毒基因组可以看作是一类新的组织破坏性药物，而病毒颗粒可以看作是一种纳米级的核酸传递载体。
[0003]单纯疱疹病毒是最常用的溶瘤病毒载体之一，利用其庞大的基因组可进行基因改造，从而提高它的溶瘤活性。溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)通常是通过删除ICP34.5来构建的，它可以有效地传递各种转基因来协助破坏肿瘤细胞。其中，I型单纯疱疹病毒(HSV
‑
1)因其选择性裂解肿瘤细胞的能力在实验和临床研究中广泛使用。
[0004]oHSV2是在单纯疱疹病毒株Ⅱ型(HSV2)标准毒株HG52的基础上，敲除了ICP34.5基因(infected cell protein 34.5)和ICP47基因(infected cell protein 47)，插入编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony stimulating factor，hGM
‑
CSF)的表达序列的新型溶瘤病毒。
[0005]对于单纯疱疹病毒株Ⅱ型(HSV2)，其中敲除的ICP34.5是一种神经毒性因子，可以抑制I型干扰素(IFN)反应，拮抗非分裂细胞内的PKR信号通路，ICP34.5基因的敲除提高了肿瘤细胞的选择性，防止神经元的感染。ICP47可以阻断TAP(与抗原加工相关的转运体)的功能，从而阻止了受感染细胞向CD8
+
T细胞呈递抗原，ICP47的敲除诱导了US11启动子的早期激活，增加溶瘤病毒治疗活性，还使健康细胞和肿瘤细胞都呈递病毒抗原，抑制健康组织的感染，免疫介导破坏肿瘤细胞，选择性繁殖溶瘤病毒。hGM
‑
CSF可以促进树突状细胞的积累和成熟，改善肿瘤抗原呈递并刺激强大的T细胞反应。
[0006]同时有研究表明，HSV
‑
2的溶瘤作用可能优于HSV
‑
1，HSV
‑
2的结构域可以激活RAS/MEK/MAPK途径并提高病毒繁殖效率。HSV
‑
2可以选择性感染肿瘤细胞并形成合胞体，比HSV
‑
1产生更好的抗肿瘤免疫反应。与HSV
‑
1溶瘤病毒相比，HSV
‑
2溶瘤病毒FusOn
‑
H2以较低的感染复数(MOI)更有效地杀死MDA
‑
MB
‑
435人乳腺癌细胞，从而产生了更多的无肿瘤小鼠。其能释放出更多的合胞体，从而使树突状细胞(DC)更有效地工作，并导致更强大的抗原交叉呈递。ICP10PK缺失的oHSV
‑
2病毒DPK通过直接溶瘤功能和诱导程序性细胞死亡途径引起癌细胞死亡。oHSV2的溶瘤作用与具有相同MOI的oHSV1的溶瘤作用相同，删除了ICP34.5和ICP47基因的新型HSV
‑
2溶瘤病毒，在4T1模型中充分展示了治疗潜力以及对免疫应答的诱导作
用。
[0007]主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)是一组与免疫应答密切相关的基因群。人的MHC称为人类白细胞抗原(humanleucocyte antigens，HLA)基因复合体，可分为HLA
ꢀⅠ
、HLA
ꢀⅡ
、HLA
ꢀⅢ
类；基因通常分为两类：经典类(Ⅰa类)以及非经典类(Ⅰb类)，在肿瘤细胞表面HLA
ꢀⅠ
a类分子的表达通常下调甚至丢失，从而逃避细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对其的识别和特异性杀伤，理论上NK细胞可以杀伤缺乏HLA
ꢀⅠ
a分子的肿瘤细胞，但这些肿瘤细胞也可以逃避NK细胞的攻击，这种现象可能与肿瘤细胞表面HLA I b分子的表达有关。
[0008]人类白细胞抗原E(HLA
‑
E)是功能和作用途径较为明确的HLA
ꢀⅠ
b类分子，具有组织分布狭窄，但细胞表面表达较低的特征，几乎在所有成人细胞表面低水平表达。但已有多项研究证实了HLA
‑
E在许多类型的人类肿瘤细胞的表面过表达。HLA
‑
E是CD94/NKG2A的主要配体，该受体在来自外周血的超过50％的CD56
bright
或CD56
dim NK细胞和CD8+T细胞的一些子集上表达，是一种抑制性受体。它们的结合会抑制CD8+CTL细胞和NK细胞对肿瘤细胞的细胞溶解活性。因此，HLA
‑
E在肿瘤细胞上的过表达是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。
[0009]前期研究发现，UV
‑
oHSV2的处理可以使BGC823、LoVo和U87MG细胞上的HLA
‑
E上调表达，且NK细胞联合UV
‑
oHSV2/HLA
‑
E抗体能够增强NK细胞抗肿瘤能力。HLA
‑
E为肿瘤细胞表面抑制性免疫检查点分子，研究oHSV2通过何种蛋白上调肿瘤细胞上HLA
‑
E的表达非常重要，这与oHSV2的治疗效果相关。
[0010]遗憾的是，由于对溶瘤病毒缺乏系统全面的研究，国内外仍然无法明确溶瘤病毒与癌细胞的作用机理，因此，需要进一步研究II型溶瘤单纯疱疹病毒与肿瘤细胞之间的作用机理，以及基于该作用机理做制备得到的检测分子、质粒，在此前提下，进一步发掘II型溶瘤单纯疱疹病毒在靶向药物中的重要应用方向。

技术实现思路

[0011]本专利技术发现了溶瘤单纯疱疹病毒上的VP5蛋白能够与肿瘤细胞的HLA
‑
E互作，能够影响肿瘤细胞表面抑制性免疫检查分子HLA
‑
E，进而能够提高NK细胞和/或CD8+CTL细胞，其中VP5蛋白是由UL19基因片段表达。
[0012]第一方面，本专利技术提供了一种UV
‑
oHSV2感染肿瘤细胞的方法，所述的感染肿瘤细胞的方法能够上调肿瘤细胞表面抑制性免疫检查分子HLA
‑
E。
[0013]在一些实施例中，所述的肿瘤细胞为BGC823、LOVO、U87
‑
MG细胞。
[0014]第二方面，本专利技术提供了一种HLA
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种UV
‑
oHSV2感染肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法能够上调肿瘤细胞表面抑制性免疫检查分子HLA
‑
E；所述的肿瘤细胞为BGC823、LOVO、U87
‑
MG细胞。2.一种HLA
‑
E
‑
GST质粒的构建方法，其特征在于，以PGEX
‑
6P
‑
1为质粒载体，插入基因为HLA
‑
E，酶切位点为EcoRI，Not I，构建HLA
‑
E
‑
GST质粒。3.一种HA
‑
HLA
‑
E质粒的构建方法，其特征在于，所述的HA
‑
HLA
‑
E质粒的构建使用的质粒载体为PCMV
‑
N
‑
HA，插入基因为HLA
‑
E，酶切位点为EcoRⅠ。4.一种HA
‑
UL19质粒的构建方法，其特征在于，所述的HA
‑
UL19质粒的构建使用质粒载体为P3xFlag
‑
CMV，插入基因为UL19，酶切位点为Hind3 BamH1。5.一种利用HLA
‑
E
‑
GST质粒制备融合蛋白的方法，其特征在于，将HLA
‑
E
‑
GST质粒转化DE3感受态，接种于LB液体培养基，摇菌；然后加入IPTG，低温诱导表达；离心收集菌体，超声破碎，离心后的上清使用GST标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘滨磊，汪洋，周芹，
申请(专利权)人：武汉滨会生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：