脐带间充质干细胞培养方法技术

本发明专利技术提供了一种脐带间充质干细胞培养方法，另外还提供了特异性针对NOS2的单克隆抗体，该抗体能够通过抑制一氧化氮合成酶的活性来治疗宫颈癌，特别是通过NOS2单克隆抗体的治疗后能够显著提高宫颈癌细胞针对脐带血间充质干细胞的敏感性，二者一起能够显著的抑制宫颈癌细胞的增殖，具有显著的协同效果。具有显著的协同效果。

【技术实现步骤摘要】
脐带间充质干细胞培养方法


[0001]本申请涉及生物领域，具体的涉及脐带间充质干细胞培养方法。

[0002][0003]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早起源于早期中胚层，能够自我更新并具有多向分化的潜能，可从成体骨髓、牙髓、脂肪组织、脐带等组织中分离。由于MSCs具有免疫调节的作用，因此MSCs在损伤组织修复和自身免疫性疾病的细胞治疗领域备受青睐。其中，来源于脐带的间充质干细胞(hUCMSCs)因具有多能性、低致瘤性、低免疫原性、增殖率高和获取方便等特点，成为了同种异体环境中细胞移植的重要适用细胞来源，其亦可能成为干细胞治疗的优先选择。人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的来源大致可以分为4种:(1)从人脐带华通胶中得到的间充质干细胞，(2)来源于人脐带血的间充质干细胞(hUCMSCs)，(3)来自人脐带血管周围组织的间充质干细胞(hUCPV
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MSCs)，(4)从羊膜中获得的间充质干细胞(hAMSCs)。
[0004]人类间充质干细胞在各种动物模型中已经被证明了可以发挥抗炎免疫调节和修复的作用。在大多数调查中发现骨髓是间充质干细胞的主要来源，但是在骨髓中收集间充质干细胞是有侵害的，并且间充质干细胞的数量髓年龄增长而减少，这就明显限制了间充质干细胞的在临床的应用。在2004年，有研究证明人脐带血有丰富的间充质干细胞，并能够诱导分化其表面标记，且类似于从各种组织中提取的间充质干细胞，例如骨髓。因此，脐带血来源的间充质干细胞已被广泛适用于各种实验模型。最近研究的焦点是脐带血间充质干细胞和癌症转移之间的关系。脐带血间充质干细胞是有吸引力的癌症靶向治疗工具，人脐带血间充质干细胞具有迁移到肿瘤的能力，它们可作为肿瘤治疗的靶向载体。目前已经有几例报告证实了间充质干细胞对癌症的疗效。研究脐带血间充质干细胞与乳腺癌干细胞在体内及体外的关系，实验中CCK
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8的结果测定了软琼脂集落的形成实验，表明人脐带血间充质干细胞可以抑制人乳腺癌细胞的生长。他们推测脐带血间充质干细胞可能通过阻断PI3K/Akt信号通路来抑制PI3K和Akt蛋白激酶的活性从而来抑制肿瘤细胞增殖。也有实验中发现脐带血间充质干细胞可以抑制原发性多形性胶质母细胞瘤的生长并引起肿瘤细胞凋亡。脐带血间充质干细胞促进原发性多形性胶质母细胞瘤的细胞凋亡是通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体造成的。脐带血间充质干细胞还可以通过分泌DKK1从而调控Wnt信号通路来抑制乳腺癌细胞MDA
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MB
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231细胞增殖。间充质干细胞是一种很有前途的治疗工具，能为肿瘤的治疗提供药物，研究中，被慢病毒转染脐带血间充质干细胞可以载体编码被甲胎蛋白启动子驱动的可溶性人类肿瘤坏死因子及相关凋亡诱导配体基因，可用来研究这些细胞对小鼠原位移植肝癌的治疗作用。他们的研究表明脐带血间充质干细胞可以有效的被慢病毒转染，并可以迁移到体内及体外的肝癌组织中，在通过静脉注射干细胞后，这些相关凋亡诱导配体在肿瘤部位得以表达，并表现出显著的抗肿瘤活性，当联合5
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FU共同使用时，这种效果将会更强。也有研究表明脐带血间充质干细胞与食管癌细胞人工融合可抑制食管癌细胞生长、增加细胞凋亡、抑制肿瘤的发生。然而，也有证据证实了脐带血间充质干细胞
和癌细胞之间相互作用会促使肿瘤细胞转移的危险性。间充质干细胞促进了乳腺癌的转移。间充质干细胞分泌的趋化因子配体5及癌细胞表达的趋化因子受体5相互作用在间充质干细胞调节肿瘤转移的过程中发挥了重要作用。随后，间充质干细胞通过分泌细胞衍生因子
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1、白细胞介素6和血管内皮生长因子来促进癌细胞转移。肿瘤的侵袭和迁移是肿瘤转移的两个步骤，为了知道脐带血间充质干细胞是否能够在体外影响肿瘤细胞侵袭，在实验中对乳腺癌细胞的迁移与脐带血间充质干细胞之间有无关系进行了测试，当Transwell下室中没有脐带血间充质干细胞时，乳腺癌细胞在每个小室中迁移和侵袭的数目是较少的，然而，在有脐带血间充质干细胞的实验组则数目明显升高，这个结果表明体外实验中脐带血间充质干细胞促进了乳腺癌细胞的迁移，这是由于细胞分泌的趋化因子造成的。同时它们排除了脐带血间充质干细胞会使乳腺癌细胞增殖，从而干扰乳腺癌细胞侵袭迁移的可能性。此外有研究表明间充质干细胞进入肿瘤组织后可分化为成纤维母细胞，进而分化为肌纤维母细胞，在肿瘤生长、浸润与转移中起重要作用。
[0005]一氧化氮合酶(NOS)是催化一氧化氮(NO)生物合成的酶，是内源性NO合成的限速酶，自1987年证实血管内皮细胞舒张因子(EDRF)的化学本质就是NO以来，NO便成为现代生物学研究中十分活跃的领域。NOS含量的变化必将伴随着NO合成的改变。已知eNOS和iNOS是NOS的两类同工酶，它们在体内发挥着不同的作用，iNOS也叫诱导型一氧化氮合酶(缩写iNOS或NOS2)。有关NOS在体内其它部位肿瘤组织中表达的研究报道很多。例如:人肝癌、食管癌、结肠腺癌、膀胱癌及前列腺等的肿瘤中发现NOS活性增高。但是，有关系统地研究NOS在宫颈癌组织中表达的研究报道却很少。已有的结果表明：eNOS、iNOS(NOS的两类同工酶)在宫颈癌中的阳性表达率明显高于其对照组织，这说明eNOS、iNOS的表达与宫颈癌的发生、发展有关。eNOS、iNOS在正常宫颈组织中的弱表达，表明由它们催化生成的较少量NO，可能参与了正常宫颈上皮的保护及分泌等生理功能，这与梅祖敏等的研究结果一致。eNOS、iNOS在宫颈癌组织中的异常表达，表明了宫颈癌局部组织中由两种NOS催化诱导合成的NO量较多，这些高水平的NO可能非但不能发挥抗肿瘤活性，反而促进了宫颈癌细胞的增殖与分化，从而促进了肿瘤细胞的生长，发挥了致瘤和促瘤生长作用。利用NOS在宫颈组织中的表达特点，将NOS作为将来早期诊断宫颈癌的检测指标之一，也可以利用NOS抑制剂来治疗宫颈癌。
[0006]但是目前，针对NOS的抑制剂研究在国内不是很多，提供的抑制剂的种类也不够丰富，针对NOS抑制剂与其他药物特别是脐带血间充质干细胞一起联用的研究也不是很多。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对现有技术的缺陷，提供了一种改进的脐带血间充质干细胞的分离和培养方法。
[0008]具体的，本专利技术提供一种脐带血间充质干细胞分离和培养方法，具体的，将婴儿脐带血采集后用Ficoll细胞分离液密度梯度离心后获得单个核细胞，Ficoll分离液与脐带血的体积比为1:1
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1:3，分离后的细胞用IMDM基础培养基离心洗涤若干次，调整细胞密度备用；将分离得到的脐血单个核细胞接种到6孔板中，加入含10％FBS+IL
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3(15μg/L)+GM
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CSF(5μg/L)+G
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CSF(5μg/L)的IMDM培养基，置37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中，3天后进行半量换液，去除未贴壁细胞.以后每3天半量换液1次，培养获得细胞即为脐带血间充质干细胞。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NOS2的单克隆抗体1A20，其特征在于轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。2.一种NOS2的单克隆抗体1A20在制备用于抑制宫颈癌细胞增殖的药物组合物中的用途，其中，该抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。3.一种NOS2的单克隆抗体1A20和脐带间充质干细胞在制备用于抑制宫颈癌细胞增殖的药物组合物中的用途；其中，该抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示；所述脐带间充质干细胞是采用如下方法制备：婴儿脐带血采集后用密度为1.077g/ml的Ficoll细胞分离液以2500r/min，30min密度梯度离心后获得单个核细胞，Ficoll分离液与脐带血的体积比为1:2，分离后的细胞用IMDM基础培养基1200r/min，3min离心洗涤3次，调整细胞密度备用；将分离得到的脐...

【专利技术属性】
技术研发人员：王杰，肖驰，
申请(专利权)人：广州连达科技有限公司，
类型：发明
国别省市：