一种稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞、复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞、复合物及其制备方法和应用，属于生物技术领域。所述稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞，为普通脂肪干细胞经SV2C过表达的慢病毒转染所得。本发明专利技术通过构建SV2C的全长基因过表达的慢病毒感染普通脂肪获得一种稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞，该脂肪干细胞可过表达SV2C蛋白，将该脂肪干细胞与A型肉毒毒素共培养可获得脂肪干细胞

【技术实现步骤摘要】
一种稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞、复合物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞、复合物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]脂肪干细胞(adipose
‑
derived stem cells，ADSCs)是由Zuk等在2001年首次从脂肪组织中分离、提取出的一种间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，具有较强组织修复的生物学功能，已成为细胞治疗和组织工程应用中的理想种子细胞。ADSCs的生物学功能包括以下三个方面：(1)多向分化潜能，ADSCs具有向多种成体细胞的分化能力，如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞(包括骨骼肌、平滑肌以及心肌细胞)等。(2)具有旁分泌功能，ADSCs可合成分泌多种类型细胞因子和成分，包括：
①
生长因子，有表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子
‑
β(TGF
‑
β)、胰岛素样生长因子(IGF)等；
②
炎性相关因子：有干扰素
‑
γ(IFN
‑
γ)、肿瘤坏死因子
‑
α(TNF
‑
α)、白细胞介素(IL
‑
1、IL
‑
8、IL
‑
9等)、单核细胞趋化蛋白
‑
1(MCP
‑
1)等；
③
外泌体(exosomes，EXO)等亚细胞颗粒，外泌体包含有来源于母细胞的RNA、DNA、蛋白质、脂质以及完整的细胞器等。
[0003]通过以上途径，脂肪干细胞能够增强细胞增殖、迁移的活力，提高受损细胞生命力、拮抗细胞凋亡，具有促进血管形成、组织修复，抑制组织炎症反应等作用，在抗衰老领域有较显著的应用效果。
[0004]研究发现，通过自体脂肪干细胞移植可治疗面部皮肤的衰老。注射到皮肤组织中的ADSCs通过分泌IGF、EGF、TGF
‑
β、IL
‑
1、TNF
‑
α等细胞因子，能够抑制成纤维细胞衰老、提高细胞活性、加强成纤维细胞合成胶原的能力，改善真皮层胶原蛋白含量降低的问题；同时可促进新生血管生成，使皮下结缔组织增多，皮肤增厚紧致，实现延缓皮肤衰老、面部的年轻化的作用。
[0005]近年来，与传统整形手术相比，许多求美者及整形美容医生已更青睐于简单、风险小、创伤小、恢复快、效果显著的注射美容。自肉毒素开始应用于美容领域以来，其使用率逐年递增，并成为目前注射美容应用人数最多的药物之一。肉毒素除了用于最早发现的除皱外，还可应用在轮廓调整、肤质改善、瘢痕治疗、抑制汗腺分泌等多个方面。最近国内报道通过对患者面部皮下多点、微量注射肉毒素，可在短时间内精确消除前额、眉间、眼外、口角等密集细小皱纹，改善患者面部皮肤粗糙，缩小毛孔，使皮肤光泽有弹性。随着科技的发展，肉毒素的联合应用是目前一大热点。由于脂肪干细胞具有多向分化能力和丰富的旁分泌功能，且因为其来源广泛、取材方便及组织损伤小等优点已成为细胞治疗和组织工程应用的理想工具。
[0006]肉毒素是肉毒杆菌在其生长过程中生产并释放的外毒素。根据其血清学特点及鉴定时间先后顺序将肉毒素分为8种不同的类型，分别是A型、B型、C1型、C2型、D型、E型、F和G型。1986年加拿大医生Carruthers等在使用肉毒素治疗眼睑痉挛时发现它可使眼周皱纹消
失，从此便将肉毒素使用于皮肤除皱研究。目前只有A型和B型毒素可作为药物使用，但用于美容医学领域的绝大部分是A型肉毒素。现国外临床上应用的A型肉毒素包括由美国Allergan公司生产的保妥适(Botox)，英国Speywood公司生产的丽舒妥(Dysport)。
[0007]通过研究表明A型肉毒素的作用机制为：(1)突触外固定：肉毒素和突触前胆碱能神经元的膜受体相互结合；(2)内化：结合后形成的复合体通过细胞吞饮的方式进入神经末梢；(3)双硫键断开，裂解突触相关蛋白；(4)毒素阻止细胞内的乙酰胆碱释放，从而达到抑制横纹肌收缩，产生相应的临床效果，即达到消除皱纹、瘦脸等目的。但肉毒素只是抑制了神经递质的释放，而非抑制其合成，所以当新的神经肌肉连接建立后，肌肉收缩功能又可在1～3个月重新恢复。
[0008]国内无论是国产还是进口的A型肉毒素，均由二硫键结合的重链和轻链组成的多肽链，该链可以被蛋白酶裂解。A型肉毒素是通过对乙酰胆碱释放所必需的蛋白质的裂解而阻断神经肌肉传导，并引起松弛性麻痹。在正常情况下肌肉收缩过程是：神经冲动
‑‑
乙酰胆碱(Ach)
‑
终板电位
‑
肌肉动作电位
‑
肌肉收缩，注射后的毒素结合在胆酰能神经末梢的受体部位，毒素肽链的重链结合在神经末梢的无髓鞘区域，毒素本身进入神经膜，乙酰胆碱被轻链阻断在胞浆内，不能通过神经肌肉接点，神经不再传递介质，肌肉就发生麻痹，从而降低肌张力，缓解肌痉挛。肉毒素通过阻断神经肌肉传导、抑制肌肉的收缩而达到治疗皱纹的作用。受注射的量影响，最早可在24h后，一般在注射毒素后48～72h出现目标肌肉的无力松弛，作用高峰通常在7～14天后到来。这种肌松弛时间是有限的，约维持3～6个月。
[0009]由于肉毒素的维持时间有限，常常需要经常注射，而且长期反复注射可能带来表情不自然、畏光、流泪、局部肿胀、淤斑、注射部位麻木、头痛、额部紧绷感、邻近部位皱纹加深等副作用；还可出现眉型改变、上睑下垂、眉下垂、轻度下睑外翻、暴露性角膜炎、视力模糊、过敏反应等。因此，为了减少其毒性，延长作用时间，更好地扬长避短，急需构建一种表达肉毒素A受体的脂肪干细胞，产生脂肪干细胞
‑
肉毒素A复合物。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞；
[0011]本专利技术的第二目的在于提供一种具有双重作用的脂肪干细胞
‑
肉毒素A复合物；
[0012]本专利技术的第三目的在于提供脂肪干细胞
‑
肉毒素A复合物的制备方法；
[0013]本专利技术的第四目的在于提供脂肪干细胞
‑
肉毒素A复合物应用。
[0014]本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：一种稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞，所述脂肪干细胞为普通脂肪干细胞经SV2C过表达的慢病毒转染所得。
[0015]进一步地，所述SV2C过表达的慢病毒采用以下方法构建：
[0016]S1.获得目的基因：设计引物合成SV2C的全长基因，为目的基因；
[0017]S2.构建重组质粒：将步骤S1获得的目的基因与GV492载体连接，用DH5α大肠杆菌菌株转化获得菌落，对菌落进行PCR获得阳性转化子；
[0018]S3.质粒抽提与转染：将含阳性转化子的菌液抽提质粒，收集SV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞，其特征在于，所述脂肪干细胞为普通脂肪干细胞经SV2C过表达的慢病毒转染所得。2.根据权利要求1所述的一种稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞，其特征在于，所述SV2C过表达的慢病毒采用以下方法构建：S1.获得目的基因：设计引物合成SV2C的全长基因，为目的基因；S2.构建重组质粒：将步骤S1获得的目的基因与GV492载体连接，用DH5α大肠杆菌菌株转化获得菌落，对菌落进行PCR获得阳性转化子；S3.质粒抽提与转染：将含阳性转化子的菌液抽提质粒，收集SV2C过表达质粒并转染293T细胞；S4.收获慢病毒：含10％FBS的低糖DMEM培养基中加入SV2C过表达质粒转染的293T细胞，培养72h后收集细胞上清液，浓缩和纯化后即为SV2C过表达的慢病毒，其中，所述的慢病毒包裹混合液为SV2C过表达质粒、pHelper1.0载体质粒、pHelper 2.0载体质粒和吉凯转染试剂的混合液。3.根据权利要求1所述的一种稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞，其特征在于，步骤S1中所述引物的上游引物的核苷酸序列为：5
’‑
AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGGAAGACTCTTACAAGGATAG
‑3’
，下游引物的核苷酸序列为：5
’‑
TCCTTGTAGTCCATACCCATCAGAACCTGGGTTCGTGTGTC
‑3’
。4.根据权利要求1所述的一种稳定结合A型肉毒毒素的脂肪干细胞，其特征在于，步骤S2中菌落PCR的上游引物核苷酸序列为：5
’‑
TTGGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：易西南，王亚如，冯仁军，田梦思，韩炎超，
申请(专利权)人：海南医学院，
类型：发明
国别省市：