一种用于肺癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种用于培养原代肺癌上皮细胞的原代细胞培养基，其含有MST1/2激酶抑制剂、ROCK激酶抑制剂、成纤维细胞生长因子、选自B27添加剂和N2添加剂中的至少一种的添加剂、表皮细胞生长因子、转铁蛋白、胃泌素、和TGFβI型受体抑制剂。本发明专利技术还涉及使用该原代细胞培养基的培养方法及其在药物疗效评估和筛选中的应用。该培养方法使用上述原代细胞培养基在包被有细胞外基质胶的培养器皿上培养肺癌原代细胞，使得肺癌原代细胞快速增殖。由本发明专利技术的原代细胞培养基和原代细胞培养方法得到的细胞模型，能够用于药物的疗效评估和筛选。能够用于药物的疗效评估和筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种用于肺癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用


[0001]本专利技术属于医药
，具体而言，涉及用于在体外培养或扩增原代肺癌上皮细胞的培养基及培养方法，还涉及培养得到的细胞在药物的疗效评估和筛选中的方法和应用。

技术介绍

[0002]肺癌是目前世界上最常见的呼吸道肿瘤。世界范围内每年新增加的肺癌患者超过180万。肺癌作为临床中最常见的恶性肿瘤，其治疗方式主要为手术、化疗、放疗、分子靶向治疗以及免疫治疗等，其中最为常用的手段为手术、化疗和放疗，但其临床治疗方式的适宜人群存在局限性。近几年，在分子生物学的兴起与发展下，肿瘤药物治疗呈现多样化趋势，其中分子靶向药物因其针对性强、安全性高等优势成为肺癌临床治疗中研究的热点。但是临床上针对众多治疗方案，怎么选择适合病人的方案就尤为重要。尽管有基因检测作为指标，但是有些病人没有基因突变，或者有些病人即使有某种突变，但是针对该突变有多种靶向药物，这时确定治疗方案在临床上有一定的难度。除了基因测序，体外对肺癌病人样本进行原代细胞培养已经成为未来体外预测疗效和指导临床用药的重要手段，但是体外快速获得肺癌原代细胞一直是亟待解决的技术问题。
[0003]功能性测试是指在体外对抗肿瘤药物在癌症患者细胞上的敏感性进行检测的方法。应用这一方法的关键在于开发生长周期短且能够代表肺癌患者自身生物学特性的肿瘤细胞模型。另外，所述细胞模型应操作便捷，能快速高效地预测临床用药的疗效，从而及时给予癌症患者精准用药指导。然而，取自癌症患者的原代肿瘤细胞在体外建立细胞模型的成功率往往很低，生长周期长，并存在成纤维细胞等间质细胞过度增殖等问题，制约着这一领域的发展。目前有两种培养原代上皮细胞/干细胞的技术在肿瘤细胞功能性测试应用领域发展得相对成熟。一种是使用经辐射的饲养细胞和ROCK激酶抑制剂Y27632来促进原代上皮细胞的生长以考察个体患者的药物敏感性的技术，即细胞条件重编程技术(Liu等，Am J Pathol，180：599
‑
607，2012)。另一种技术是体外3D培养成体干细胞从而获得类似于组织器官的类器官技术(Hans Clevers等，Cell，11，172(1
‑
2)：373
‑
386，2018)。
[0004]然而，这两种技术都存在一定的局限性。细胞重编程技术是一种将患者自体原代上皮细胞与鼠源性饲养细胞共培养的技术。在对患者原代细胞进行药物敏感性测试时，这些鼠源性细胞的存在会干扰患者自体原代细胞的药物敏感性检测结果；但如果撤除鼠源性饲养细胞，病人自体原代细胞就脱离了重编程环境，细胞的增殖速率和细胞内信号通路会发生明显的改变(Liu等，Am J Pathol，183(6)：1862
‑
1870，2013；Liu等，Cell Death Dis.，9(7)：750，2018)，从而使患者自体原代细胞对药物的响应结果受到较大影响。类器官技术是将患者自体原代上皮细胞包埋在细胞外基质内进行体外三维立体培养的技术，该技术无需饲养细胞，因此不存在鼠源性饲养细胞的干扰问题。但是类器官技术的培养基内需添加多种特定的生长因子(如Wnt蛋白和R
‑
spondin家族蛋白)，成本昂贵，不适于普及到临床进行大规模应用。另外，类器官在整个培养过程中均需将细胞包埋在细胞外基质胶中，其细胞
接种、传代和药物敏感性测试的铺板步骤相较于2D培养操作繁琐费时，且该技术所形成的类器官大小尺寸不好控制，易出现部分类器官生长过大而导致内部发生坏死的情况。因此，类器官技术相较于2D培养技术可操作性和适用性不强，需要专业技术人员操作，不适合大规模广泛应用于临床体外药物敏感性检测(Nick Barker，Nat Cell Biol，18(3)：246
‑
54，2016)。
[0005]鉴于以上技术的局限性，临床上需要开发一种原代肺癌上皮细胞培养技术，其培养周期短，成本可控，操作便捷，不受外源性细胞干扰。在将该技术应用于构建原代肺癌肿瘤细胞模型时，所培养的肺癌肿瘤细胞能代表肺癌患者自身的生物学特性。通过体外评估抗肿瘤药物在不同癌症患者个体所衍生的细胞模型上的敏感性，来提高临床上抗肿瘤药物的响应率，减少不合适的药物给患者造成的痛苦及医疗资源的浪费。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在针对现有技术的不足，提供一种用于培养原代肺癌上皮细胞的培养基以及使用该培养基的原代肺癌上皮细胞的培养方法。采用本专利技术的原代肺癌上皮细胞培养基和培养方法进行细胞培养，能够实现体外培养周期短、成本可控、操作便捷并不受外源性细胞干扰的目的。在该技术应用于构建原代肺癌肿瘤细胞模型时，能够获得具有肺癌患者自身生物学特性的原代肺癌肿瘤细胞，并能够应用于新药筛选和体外药物敏感性检测。
[0007]本专利技术的一个方面在于提供一种用于培养原代肺癌上皮细胞的原代细胞培养基，其含有MST1/2激酶抑制剂；选自Y27632、法舒地尔、和H
‑
1152中的至少一种的ROCK激酶抑制剂；成纤维细胞生长因子(FGF7)；选自B27添加剂和N2添加剂中的至少一种的添加剂；表皮细胞生长因子(EGF)；转铁蛋白(IGF
‑
1)；胃泌素(IL
‑
6)；选自A83
‑
01、SB431542、Repsox、SB505124、SB525334、SD208、LY36494、和SJN2511中的至少一种的TGFβI型受体抑制剂，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
[0008][0009]其中，
[0010]R1选自C1
‑
C6烷基、C3
‑
C6环烷基、C4
‑
C8环烷基烷基、C2
‑
C6螺环烷基、以及任选地被1
‑
2个独立地R6取代的芳基(例如苯基和萘基等)、芳基C1
‑
C6烷基(例如苯甲基等)和杂芳基(例如噻吩基等)；
[0011]R2和R3各自独立地选自C1
‑
C6烷基，优选C1
‑
C3烷基，更优选甲基；
[0012]R4和R5各自独立地选自氢、C1
‑
C6烷基、C3
‑
C6环烷基、C4
‑
C8环烷基烷基、C1
‑
C6烷基羟基、C1
‑
C6卤代烷基、C1
‑
C6烷基氨基C1
‑
C6烷基、C1
‑
C6烷氧基C1
‑
C6烷基、和C3
‑
C6杂环基
C1
‑
C6烷基(所述杂环基选自例如哌啶基、四氢吡喃基等)；
[0013]R6选自卤素(优选氟和氯，更优选氟)、C1
‑
C6烷基(优选甲基)、C1
‑
C6烷氧基(优选甲氧基)、和C1
‑
C6卤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于培养原代肺癌上皮细胞的原代细胞培养基，其特征在于：含有MST1/2激酶抑制剂；选自Y27632、法舒地尔、和H
‑
1152中的至少一种的ROCK激酶抑制剂；成纤维细胞生长因子；选自B27添加剂和N2添加剂中的至少一种的添加剂；表皮细胞生长因子；转铁蛋白；胃泌素；选自A83
‑
01、SB431542、Repsox、SB505124、SB525334、SD208、LY36494、和SJN2511中的至少一种的TGFβI型受体抑制剂，其中，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，其中，R1选自C1
‑
C6烷基、C3
‑
C6环烷基、C4
‑
C8环烷基烷基、C2
‑
C6螺环烷基、以及任选地被1
‑
2个独立地R6取代的芳基、芳基C1
‑
C6烷基和杂芳基；R2和R3各自独立地选自C1
‑
C6烷基；R4和R5各自独立地选自氢、C1
‑
C6烷基、C3
‑
C6环烷基、C4
‑
C8环烷基烷基、C1
‑
C6烷基羟基、C1
‑
C6卤代烷基、C1
‑
C6烷基氨基C1
‑
C6烷基、C1
‑
C6烷氧基C1
‑
C6烷基、和C3
‑
C6杂环基C1
‑
C6烷基；R6选自卤素、C1
‑
C6烷基、C1
‑
C6烷氧基、和C1
‑
C6卤代烷基。2.如权利要求1所述的原代细胞培养基，其中R1选自C1
‑
C6烷基、C3
‑
C6环烷基、C4
‑
C8环烷基烷基、C2
‑
C6螺环烷基、以及任选地被1
‑
2个独立地R6取代的苯基、萘基、苯甲基和噻吩基；R2和R3各自独立地选自C1
‑
C3烷基；R4和R5各自独立地选自氢、C1
‑
C6烷基、C3
‑
C6环烷基、C4
‑
C8环烷基烷基、C1
‑
C6烷基羟基、C1
‑
C6卤代烷基、C1
‑
C6烷基氨基C1
‑
C6烷基、C1
‑
C6烷氧基C1
‑
C6烷基、哌啶基C1
‑
C6烷基、和四氢吡喃基C1
‑
C6烷基；R6选自卤素、C1
‑
C6烷基、C1
‑
C6烷氧基、和C1
‑
C6卤代烷基。3.如权利要求1所述的原代细胞培养基，其中所述MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
其中，R1选自C1
‑
C6烷基、任选地被1
‑
2个独立地R6取代的苯...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘青松，胡洁，陈程，黄涛，
申请(专利权)人：合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：