一种二氧化锰纳米片介导的呕吐毒素检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种二氧化锰纳米片介导的呕吐毒素检测试剂盒和检测方法，属于呕吐毒素免疫检测技术领域。该试剂盒包含固定反应板、呕吐毒素单克隆抗体、呕吐毒素抗原、酶标二抗、AuNP@MnO2溶液、AuNPs溶液、2

【技术实现步骤摘要】
一种二氧化锰纳米片介导的呕吐毒素检测试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及呕吐毒素免疫检测
，特别是涉及一种二氧化锰纳米片介导的呕吐毒素检测试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]脱氧雪腐镰刀菌烯醇呕吐毒素(DON)，是由主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生的一种真菌毒素。呕吐毒素是食品中常见的真菌毒素，广泛存在于各类粮食作物及其制品中，由于其稳定性高，不易除去，是目前全球污染率较高的真菌毒素之一，其对农作物的污染每年都会导致巨大的经济损失，已被世界卫生组织列为最危险的食品污染物之一。由于它具有很高的细胞毒素及免疫抑制性质，因此，对人类及动物的健康构成了威胁，特别是对免疫功能具有明显的影响。根据DON的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激。当人摄入了被DON污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。1998年，在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为3类致癌物。欧盟要求呕吐毒素要小于1.0mg/kg；中国饲料要求低于1ppm。
[0003]DON最早是从感染了赤霉病的大麦中分离出来的，化学名称为3，7，15
‑
三羟基
‑
12，13
‑
环氧单端孢霉
‑9‑
烯
‑8‑
酮，是一种无色针状结晶，相对分子质量为296.32，分子式为C
15
H
20
O6，熔点为151～153℃，是一种极性化合物，可以溶于水和一些极性有机溶剂，如：含水甲醇、含水乙醇、乙酸乙酯等。
[0004]目前，对DON含量常用的检测方法有：胶体金快速定量法，酶联免疫色谱法，高效液相色谱法等。酶联免疫色谱法和胶体金快速定量法都是快速定量DON检测方法，这两种方法具备前处理简单、快速、方便等特点，比较适用于大批量样品的快速筛查，但是存在灵敏度低等缺陷。而高效液相色谱法相比于胶体金快速定量法和酶联免疫色谱法灵敏度高，但是前处理相对比较麻烦，不易广泛推广。因此，本专利技术提供一种操作简单且具有较高灵敏度的呕吐毒素检测试剂盒。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种二氧化锰纳米片介导的呕吐毒素检测试剂盒和检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，该试剂盒具有可视化、简单、低成本、高通量等特点，且在检测时不与其他结构类似物发生交叉反应，特异性高，具有市场开发价值和广泛推广空间。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种二氧化锰纳米片介导的呕吐毒素检测试剂盒，所述呕吐毒素检测试剂盒包含固定反应板、呕吐毒素单克隆抗体、呕吐毒素抗原、酶标二抗、AuNP@MnO2溶液、AuNPs溶液、2
‑
(磷酸二氢)
‑
L
‑
抗坏血酸和洗涤液。
[0008]进一步地，所述呕吐毒素抗原为DON
‑
BSA完全抗原，包被于所述固定反应板。
[0009]进一步地，所述DON
‑
BSA完全抗原的制备方法为：
[0010]将DON标准品与马来酸酐加入至甲苯中加热搅拌20
‑
22h，所得制剂蒸干、酸化、萃取、重结晶后得到呕吐毒素半抗原；取牛血清蛋白溶于PBS溶液中，加入EDC后，与呕吐毒素半抗原混合搅拌1
‑
1.5h，再加入EDC，暗处搅拌反应并过夜；最后用PBS透析3
‑
5天，得到DON
‑
BSA完全抗原；
[0011]所述DON
‑
BSA完全抗原包被于所述固定反应板的方法为：
[0012]向所述固定反应板中加入稀释后的DON
‑
BSA完全抗原，于35
‑
37℃包被2
‑
3h即可。
[0013]进一步地，所述AuNPs溶液的制备方法为：将HAuCl4·
3H2O溶液煮沸，加入柠檬酸三钠，待混合溶液变红后，煮沸即得；
[0014]所述AuNP@MnO2溶液的制备方法为：将获得的AuNPs溶液中加入KMnO4，搅拌后加热即得。
[0015]进一步地，所述呕吐毒素单克隆抗体是将抗DON单克隆抗体稀释至0.05
‑
0.07μg/mL制备成的。
[0016]进一步地，所述酶标二抗包括血清碱性磷酸酶ALP标记的羊抗鼠二抗。
[0017]本专利技术还提供一种利用所述的呕吐毒素检测试剂盒检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇呕吐毒素含量的方法，包括以下步骤：
[0018](1)取待测样品，与浓度为16
‑
32μg/mL的呕吐毒素单克隆抗体溶液等体积混匀，加入至包被DON
‑
BSA完全抗原的固定反应板中，于35
‑
37℃反应1
‑
2h；
[0019](2)向反应后的固定反应板中加入5
‑
20μg/mL的血清碱性磷酸酶ALP标记的羊抗鼠二抗，按照步骤(1)的反应条件再次反应；
[0020](3)向再次反应后的固定反应板中加入20
‑
40mmol/L的2
‑
(磷酸二氢)
‑
L
‑
抗坏血酸，于36
‑
38℃孵育30
‑
45min，之后加入AuNP@MnO2和AuNPs的混合物，于36
‑
37℃显色后，读取蓝色值判断待测样品中DON呕吐毒素含量。
[0021]进一步地，在步骤(3)中，所述AuNP@MnO2的添加量为16
‑
30μL。
[0022]进一步地，在步骤(3)中，对显色后的固定反应板进行拍照，应用Reader软件读取拍照的固定反应板的蓝色值，以蓝色变化值为Y值，按照线性回归方程Y＝39.06X+49.40计算待测样品中DON呕吐毒素含量。
[0023]本专利技术还提供一种所述的呕吐毒素检测试剂盒在食品或饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇呕吐毒素免疫检测中的应用。
[0024]本专利技术公开了以下技术效果：
[0025]本专利技术制备的DON
‑
BSA完全抗原以及相应的单克隆抗体DON
‑
McAb两者结合的特异性强、纯度好、重复性强、便于质量控制。二氧化锰纳米片构建的生物传感器具有较高的灵敏度和选择性以及快速的检测能力。因此，本专利技术建立了一种基于二氧化锰纳米片介导的脱氧雪腐镰刀菌烯醇呕吐毒素检测试剂盒，采用等离子体cELISA方法，通过手机拍照读取蓝色值，即可完成对呕吐毒素的定量检测。
[0026]本专利技术制备的ELISA试剂盒具有可视化、简单、低成本、高通量等特点，同时在检测时不与其他结构类似物发生交叉反应，特异性高；且具有长期稳定的特点，实用性较强、容易保存、具有市场开本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种二氧化锰纳米片介导的呕吐毒素检测试剂盒，其特征在于，所述呕吐毒素检测试剂盒包含固定反应板、呕吐毒素单克隆抗体、呕吐毒素抗原、酶标二抗、AuNP@MnO2溶液、AuNPs溶液、2
‑
(磷酸二氢)
‑
L
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抗坏血酸和洗涤液。2.根据权利要求1所述的呕吐毒素检测试剂盒，其特征在于，所述呕吐毒素抗原为DON
‑
BSA完全抗原，包被于所述固定反应板。3.根据权利要求2所述的呕吐毒素检测试剂盒，其特征在于，所述DON
‑
BSA完全抗原的制备方法为：将DON标准品与马来酸酐加入至甲苯中加热搅拌20
‑
22h，所得制剂蒸干、酸化、萃取、重结晶后得到呕吐毒素半抗原；取牛血清蛋白溶于PBS溶液中，加入EDC后，与呕吐毒素半抗原混合搅拌1
‑
1.5h，再加入EDC，暗处搅拌反应并过夜；最后用PBS透析3
‑
5天，得到DON
‑
BSA完全抗原；所述DON
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BSA完全抗原包被于所述固定反应板的方法为：向所述固定反应板中加入稀释后的DON
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BSA完全抗原，于35
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37℃包被2
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3h即可。4.根据权利要求1所述的呕吐毒素检测试剂盒，其特征在于，所述AuNPs溶液的制备方法为：将HAuCl4·
3H2O溶液煮沸，加入柠檬酸三钠，待混合溶液变红后，煮沸即得；所述AuNP@MnO2溶液的制备方法为：将获得的AuNPs溶液中加入KMnO4，搅拌后加热即得。5.根据权利要求1所述的呕吐毒素检测试剂盒，其特征在于，所述呕吐毒素单克隆抗体是将抗DON单克隆抗体稀释至0.05
‑
0.07μg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭帅，徐宁，刘琰，金雪敏，代伟长，曹勇，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：