柱前衍生-高效液相色谱测定大米肽中氨基酸含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种柱前衍生

【技术实现步骤摘要】
柱前衍生
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高效液相色谱测定大米肽中氨基酸含量的方法


[0001]本专利技术涉及大米肽中氨基酸含量的方法领域。更具体地说，本专利技术涉及一种柱前衍生
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高效液相色谱测定大米肽中氨基酸含量的方法。

技术介绍

[0002]目前，测定氨基酸的检测方法有直接测定法和间接测定法，直接测定法有液相色谱
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串联质谱法和离子色谱
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积分脉冲安培法；间接测定法有柱前衍生和柱后衍生法，使用最为广泛的就是柱后衍生法(氨基酸分析仪等)，但需要专一设备，仪器用途单一，而且无法对多种氨基酸同时进行检测，同时进行检测分析。

技术实现思路

[0003]为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，本专利技术的一优选实施方案提供了一种柱前衍生
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高效液相色谱测定大米肽中氨基酸含量的方法，包括以下步骤：
[0004]步骤S1、标准溶液的制备
[0005]分别量取16种氨基酸的混合标准溶液，并用盐酸溶液稀释成不同浓度的标准溶液，制备成标准曲线；
[0006]步骤S2、水解氨基酸和游离氨基酸的制备
[0007]制备得到水解氨基酸和游离氨基酸；
[0008]步骤S3、样品的衍生
[0009]利用异硫氰酸苯酯乙腈溶液、三乙胺乙腈溶液对样品进行衍生处理；
[0010]步骤S4、柱前衍生
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高效液相色谱测定
[0011]色谱柱：Athena AAA 4.6
×
250mm，5μm；
[0012]柱温：30
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40℃；
[0013]流速：0.8
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1.2mL/min；
[0014]检测波长：254nm；
[0015]进样量：5μL；
[0016]流动相A：甲醇:乙腈:水＝20:60:20；流动相B：50mmol/L乙酸钠溶液。
[0017]优选地，步骤S1、标准溶液的制备，具体包括以下操作：
[0018]分别量取16种氨基酸的混合标准溶液2.5μmol/mL，其中胱氨酸浓度为1.25μmol/mL，再用0.1mol/L的盐酸溶液逐步稀释制备四种浓度的氨基酸混合标准溶液，分别成浓度1.25μmol/mL的氨基酸混合标准溶液、浓度0.5μmol/mL的氨基酸混合标准溶液、浓度0.25μmol/mL的氨基酸混合标准溶液、浓度0.125μmol/mL氨基酸混合标准溶液，制备成标准曲线。
[0019]优选地，步骤S2、水解氨基酸和游离氨基酸的制备，具体包括以下操作：
[0020]步骤S21、水解氨基酸的制备
[0021]称取大米肽样品80.00mg放入水解管中，加入含0.1％苯酚6mol/L盐酸10mL，将水解管在充氮2～3min，然后对水解管进行封口处理；
[0022]将已封口的水解管放在165℃的恒温箱中水解1h，取出冷却至室温；
[0023]打开水解管，将水解液转移至100mL容量瓶内，用少量水多次冲洗水解管，水解液移入同一100mL容量瓶内，定容，过滤；
[0024]吸取3mL滤液移入试管中，在60℃氮吹条件下吹干，用1mL超纯水完全溶解后转移至1.5mL离心管中(样品浓缩倍数为3倍)，备用；
[0025]步骤S22、游离氨基酸的制备
[0026]称取样品300.00mg，用0.1mol/L盐酸定容至10mL容量瓶中，过滤，备用。
[0027]优选地，步骤S3、样品的衍生，具体包括以下操作：
[0028]室温下，取步骤S21制备的水解氨基酸或步骤S22制备的游离氨基酸200μL置于1.5mL离心管中，加入0.2mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL、1mol/L三乙胺乙腈溶液100μL，混匀，室温下放置1h后加入400μL正己烷，漩涡混合器振荡5
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10s，静置10min，吸取下层溶液200μL和800μL超纯水混合，过0.45μm滤膜，得样品溶液，待进样。
[0029]优选地，所述16种氨基酸分别为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸以及赖氨酸。
[0030]本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术以PITC为柱前衍生剂，结合紫外检测器定量检测16种氨基酸含量。该方法操作简便、快速、干扰小、衍生物稳定、应用广泛，为快速分析多种氨基酸提供了良好的途径。
[0031]本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0032]图1为本专利技术中一实施方案中采用本专利技术的洗脱梯度的色谱图；
[0033]图2为本专利技术中一实施方案中等度洗脱的色谱图。
具体实施方式
[0034]下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0035]以下描述用于揭露本专利技术以使本领域技术人员能够实现本专利技术。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变形。在以下描述中界定的本专利技术的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本专利技术的精神和范围的其他技术方案。
[0036]本领域技术人员应理解的是，在本专利技术的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本专利技术的限制。
[0037]可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不
能理解为对数量的限制。
[0038]本专利技术的一优选实施方案提供了一种柱前衍生
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高效液相色谱测定大米肽中氨基酸含量的方法，包括以下步骤：
[0039]步骤S1、标准溶液的制备
[0040]分别量取16种氨基酸的混合标准溶液，并用盐酸溶液稀释成不同浓度的标准溶液，制备成标准曲线；16种氨基酸分别为天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)以及赖氨酸(Lys)。
[0041]具体的，分别量取16种氨基酸的混合标准溶液2.5μmol/mL，其中胱氨酸浓度为1.25μmol/mL，再用0.1mol/L的盐酸溶液逐步稀释制备四种浓度的氨基酸混合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柱前衍生
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高效液相色谱测定大米肽中氨基酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、标准溶液的制备分别量取16种氨基酸的混合标准溶液，并用盐酸溶液稀释成不同浓度的标准溶液，制备成标准曲线；步骤S2、水解氨基酸和游离氨基酸的制备制备得到水解氨基酸和游离氨基酸；步骤S3、样品的衍生利用异硫氰酸苯酯乙腈溶液、三乙胺乙腈溶液对样品进行衍生处理；步骤S4、柱前衍生
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高效液相色谱测定色谱柱：Athena AAA 4.6
×
250mm，5μm；柱温：30
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40℃；流速：0.8
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1.2mL/min；检测波长：254nm；进样量：5μL；流动相A：甲醇:乙腈:水＝20:60:20；流动相B：50mmol/L乙酸钠溶液。2.根据权利要求1所述的柱前衍生
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高效液相色谱测定大米肽中氨基酸含量的方法，其特征在于，步骤S1、标准溶液的制备，具体包括以下操作：分别量取16种氨基酸的混合标准溶液2.5μmol/mL，其中胱氨酸浓度为1.25μmol/mL，再用0.1mol/L的盐酸溶液逐步稀释制备四种浓度的氨基酸混合标准溶液，分别成浓度1.25μmol/mL的氨基酸混合标准溶液、浓度0.5μmol/mL的氨基酸混合标准溶液、浓度0.25μmol/mL的氨基酸混合标准溶液、浓度0.125μmol/mL氨基酸混合标准溶液，制备成标准曲线。3.根据权利要求1所述的柱前衍生
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高效液相色谱测定大米肽中氨基酸含量的方法，其特征在于，步骤S2、水解氨基酸和游离氨基酸的制备，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈曦，刘嵬，余波，杨晓，黄晶，黄莹，胡武瑶，
申请(专利权)人：湖北跃海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：