一种大肠杆菌发酵生产dsRNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌发酵生产双链RNA(dsRNA)的方法，本发明专利技术采用大肠杆菌发酵生产dsRNA，在发酵培养阶段，对发酵罐葡萄糖补糖速度进行控制，选择在细胞生长不同阶段控制不同葡萄糖补料速度，同时在诱导后通过阶段降低温度和阶段降低葡萄糖补糖速度，降低发酵过程中的乙酸积累量，提高发酵水平。发酵周期短、菌体密度低，产率高；而且工艺简单，易提取，环境污染低，降低了生产成本，有利于工业化生产的推广和应用。推广和应用。推广和应用。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌发酵生产dsRNA的方法


[0001]本专利技术涉及一种大肠杆菌发酵生产dsRNA的方法，属于发酵


技术介绍

[0002]RNA干扰(RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的序列特异性基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是研究多种生物基因功能的有效手段。RNAi技术作为新兴的基因阻抑方法，在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机理研究等领域得到了广泛应用。
[0003]现阶段，体外制备siRNA的方法各有优缺点，化学合成方法能制备高质量的siRNA，但价格高，定制周期长；体外转录方法合成siRNA，成本相对较低，但实验的规模和量受到限制。利用大肠杆菌发酵制备双链RNA样品，可在短时间内高效快捷的生产大量长链双链RNA，既缩短了化学合成所需的制备周期，降低了高额的费用，又突破了体外转录的规模限制。但是现有的发酵大肠杆菌生产dsRNA产量低，并且发酵产物中dsRNA比例低，后期纯化难度大。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种大肠杆菌发酵生产dsRNA的方法。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种大肠杆菌发酵生产dsRNA的方法，包括如下步骤：
[0006]S1、制备表达dsRNA的大肠杆菌的种子液；
[0007]S2、将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵；在发酵过程中，控制溶氧为30％～40％，发酵温度为36～38℃，至溶氧第一次回升开始按照1～3g/L/h补糖速度进行补糖，并在2
‑
4h内将补糖速度逐步提高至5～7g/L/h；
[0008]S3、发酵至OD
600
达到18～22，用0.4～1.0mmol/L IPTG诱导剂诱导5～10h后放罐；其中，在加入诱导剂之后进行降温、降溶氧和降低补糖速度调控，所述降温是降低至30～35℃，降溶氧是降低至20％～30％，降低补糖速度是每小时降低1～2g/L/h补糖速度，3～5h后补糖速度调整至1～3g/L/h。
[0009]进一步地，所述降温是梯度降温，在加入诱导剂之后温度降低至34～36℃，加入诱导剂1～3h后温度降低至30～33℃。
[0010]进一步地，所述发酵培养基包括葡萄糖4～6g/L、KH2PO
4 8～12g/L、一水柠檬酸3～5g/L、MgSO4·
7H2O 1～3g/L、(NH4)2SO41～3g/L，微量元素母液0.5～1.5mL/L，所述微量元素母液包括CoCl2·
6H2O 0.10～0.15g/L，CuSO4·
5H2O 0.10～0.15g/L，FeSO4·
7H2O 5～7g/L，MnSO4·
H2O 0.3～0.5g/L，ZnSO4·
7H2O 3～5g/L。
[0011]进一步地，所述大肠杆菌为表达烟草花叶病毒的外壳蛋白基因的大肠杆菌工程菌株。
[0012]进一步地，在整个发酵过程中，控制pH在6.8～7.2之间。
[0013]进一步地，在接种前，控制搅拌140～160rpm，通气量0.4～0.6VVM，压力0.04～
0.06Mpa。
[0014]进一步地，所述pH通过氨水进行调控。
[0015]进一步地，在S2步骤中，补糖速度每半小时提高一次。
[0016]进一步地，所述种子液通过如下方法制备：将大肠杆菌菌种划线接种至LB固体培养基上培养得到单菌落；挑取单菌落，接种至LB液体培养基中培养得到一级种子液；将一级种子液接种至二级种子培养基中培养得到二级种子液。
[0017]进一步地，所述二级种子培养基包括葡萄糖8～12g/L、KH2PO
4 12～16g/L、K2HPO4·
3H2O 10～14g/L、一水柠檬酸0.8～1.2g/L、MgSO4·
7H2O 0.8～1.2g/L、(NH4)2SO
4 4～6g/L，微量元素母液0.5～1.5mL/L，所述微量元素母液包括CoCl2·
6H2O 0.10～0.15g/L，CuSO4·
5H2O 0.10～0.15g/L，FeSO4·
7H2O 5～7g/L，MnSO4·
H2O 0.3～0.5g/L，ZnSO4·
7H2O 3～5g/L。
[0018]本专利技术的有益效果是：
[0019]目前dsRNA属于高密度发酵，如果继续提高菌体密度的同时容易提高乙酸浓度，会抑制目标dsRNA，诱导同时会提高菌体自身核酸浓度，从而降低目标dsRNA浓度比例，加大目标dsRNA提纯难度。本专利技术采用大肠杆菌发酵生产dsRNA，在发酵培养阶段，对发酵罐葡萄糖补糖速度进行控制，选择在细胞生长不同阶段控制不同葡萄糖补料速度，同时在添加诱导剂后通过阶段降低温度和阶段降低葡萄糖补糖速度，降低发酵过程中的乙酸积累量，提高发酵水平，并且能够提升目标dsRNA浓度比例，利于后期核酸纯化收率。
附图说明
[0020]图1为实施例4中样品的高效液相色谱图；
[0021]图2为实施例5中样品的高效液相色谱图；
[0022]图3为实施例5中目标dsRNA发酵过程含量变化电泳图，其中泳道M为DL5000 Marker，泳道1
‑
4分别对应诱导后4h、6h、8h和10h；
[0023]图4为重组载体pT7B
‑
TMV的质粒图谱。
具体实施方式
[0024]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0025]1、试剂：葡萄糖、KH2PO4、K2HPO4·
3H2O、一水柠檬酸、MgSO4·
7H2O、(NH4)2SO4、酵母粉、蛋白胨、氨苄青霉素、异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷(IPTG)。
[0026]2、材料：SW
‑
CJ
‑
IFD型单人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；LRH
‑
150F生化培养基箱，上海一恒科学仪器有限公司；MQL
‑
S2R震荡培养箱，上海旻泉仪器有限公司；500L、100L、50L发酵罐，上海保兴生化设备有限公司；D
‑
30M High Pressure Homogenizer；CA
‑
01工业冷水机，深圳市科姆森制冷设备有限公司；OST
‑
550无油空气压缩机，台州市奥突斯工贸有限公司；PE
‑
15AZ螺杆式空气压缩机，培肯(上海)压缩机有限公司；LDR0.064
‑
0.8全自动电加热蒸汽发生器，上海扬诺锅炉制造有限公司；UV2000型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌发酵生产dsRNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备表达dsRNA的大肠杆菌的种子液；S2、将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵；在发酵过程中，控制溶氧为30％～40％，发酵温度为36～38℃，至溶氧第一次回升开始按照1～3g/L/h补糖速度进行补糖，并在2
‑
4h内将补糖速度逐步提高至5～7g/L/h；S3、发酵至OD
600
达到18～22，用0.4～1.0mmol/L IPTG诱导剂诱导5～10h后放罐；其中，在加入诱导剂之后进行降温、降溶氧和降低补糖速度调控，所述降温是降低至30～35℃，降溶氧是降低至20％～30％，降低补糖速度是每小时降低1～2g/L/h补糖速度，3～5h后补糖速度调整至1～3g/L/h。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降温是梯度降温，在加入诱导剂之后温度降低至34～36℃，加入诱导剂1～3h后温度降低至30～33℃。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖4～6g/L、KH2PO
4 8～12g/L、一水柠檬酸3～5g/L、MgSO4·
7H2O 1～3g/L、(NH4)2SO41～3g/L，微量元素母液0.5～1.5mL/L，所述微量元素母液包括CoCl2·
6H2O 0.10～0.15g/L，CuSO4·
5H2O0.10～0.15g/L，FeSO4·
7H2O 5～7g/L，MnSO4·
H2O 0.3～0.5g/L，ZnSO4·
7H2O 3～...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建辉，唐雪明，秦斌钰，马樱芳，黄永奎，张恩，
申请(专利权)人：硅羿科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：