一种结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药基因突变的检测试剂及其试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药基因突变的检测试剂及其试剂盒和方法，涉及生物检测领域，本发明专利技术提供的引物探针组合包括序列如SEQ ID No.1～2所示的引物对和SEQ ID No.3、4或5所示的探针，能用于检测氟喹诺酮类药物耐药性，对氟喹诺酮类药物耐药基因突变覆盖率均可达90％以上，探针采用了特殊修饰，能够更好的检测并区分痰液、肺泡灌洗液或分离培养物样本中结核分枝杆菌gyrA基因的四种氟喹诺酮耐药突变；基于检测结果结合临床经验，可判断具体突变位点及类型在临床中出现的耐药情况，为结核分枝杆菌感染的患者提供更为准确科学的辅助诊疗依据。更为准确科学的辅助诊疗依据。更为准确科学的辅助诊疗依据。

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药基因突变的检测试剂及其试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药基因突变的检测试剂及其试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]结核病(Tuberculosis，TB)是一种慢性传染性疾病，多发生在肺部，以肺结核最为常见。当普通肺结核患者治疗依从性不好、治疗方案不合理、消化系统吸收障碍等原因，导致体内的结核分枝杆菌变得更加厉害，不能被一种或多种抗结核药物所杀死(即对抗结核药物出现耐药)。如果病人感染的结核分枝杆菌对一种或一种以上的抗结核药物产生了耐药性，即为耐药结核病。据WHO/IUATLD的最新耐药监测估计，在新病人中，10.2％的病人至少对一种抗结核药物耐药，1.1％为多重耐药结核(MDR
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TB)；在复治病人中，18.4％的病人至少对一种抗结核药物耐药，MDR
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TB耐药率7.0％。多重耐药结核病为结核病的防治带来巨大的挑战。
[0003]氟喹诺酮类药物是人工合成药物，应用于耐药结核的临床治疗中，在治疗中起着核心的作用。氟喹诺酮类药物目前在临床上在尝试是否可以作为一线药物，缩短TB治疗的疗程，氟喹诺酮类药物在长期的一段时间都会被使用。它们的使用会伴随着抗药性的产生，需要发展早期、灵敏、准确的检测技术进行监测。
[0004]氟喹诺酮耐药肺结核需通过传统药物敏感性试验或是分子生物学快速检测技术来诊断。传统药物敏感性实验报告周期长达6～8周，不利于结核分枝杆菌感染的快速诊疗。<br/>[0005]目前，市面上应用的结核耐药分子诊断试剂存在一些问题；例如，厦门致善生物的结核分枝杆菌耐药突变检测试剂，其专利(CN201110137832.4)专利技术不可区分氟喹诺酮耐药的具体突变位点类型；现有的结核耐药分子诊断试剂还存在检测时间长，成本高，检测灵敏度不高、特异性不强等问题。
[0006]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药基因突变的检测试剂及其试剂盒和方法。
[0008]本专利技术是这样实现的：
[0009]第一方面，本专利技术实施例提供了一种核酸组合物，其包括：核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示的引物对。
[0010]可选地，所述核酸组合物还包括探针，探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.3。
[0011]可选地，所述探针5
’
端有1～5个与靶标不配对的碱基序列。
[0012]第二方面，本专利技术实施例提供了一种检测试剂，其包括前述实施例所述的核酸组合物。
[0013]第三方面，本专利技术实施例提供了一种检测试剂盒，其包括前述实施例所述的核酸组合物或前述实施例所述的检测试剂。
[0014]第四方面，本专利技术实施例提供了如前述实施例所述的核酸组合物在制备结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药性或结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药基因突变的检测试剂或试剂盒中的应用。
[0015]第五方面，本专利技术实施例提供了一种结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药基因突变的分子检测方法，其包括：采用前述实施例所述的核酸组合物或前述实施例所述的检测试剂或前述实施例所述的检测试剂盒对样本进行PCR检测，所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
[0016]本专利技术具有以下有益效果：
[0017]本专利技术提供的引物探针组合用于检测氟喹诺酮类药物耐药性，扩增片段对氟喹诺酮类药物耐药基因突变的覆盖率均可达90％以上；并且采用了一种5
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端特殊修饰的探针，能够检测并区分痰液、肺泡灌洗液或分离培养物样本中结核分枝杆菌gyrA基因的A90V、D94G、D94A和D94N四种氟喹诺酮耐药突变；根据临床经验，初步判断具体突变位点及类型在临床中出现的耐药情况(耐药基因类型及浓度)，为结核分枝杆菌感染的患者提供更为准确科学的辅助诊疗依据。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0019]图1为gyrA基因A90V、D94G、D94A和D94N四种耐药突变基因检测结果；
[0020]图2为5
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端有2个翘尾碱基的探针与普通探针的比较结果；
[0021]图3为5
’
端有5个翘尾碱基的探针与普通探针的比较结果；
[0022]图4为gyrA A90V突变位点检出比例考察；
[0023]图5为gyrA D94G突变位点检出比例考察；
[0024]图6为gyrA D94A突变位点检出比例考察；
[0025]图7为gyrA D94N突变位点检出比例考察；
[0026]图8为gyrA W野生(敏感型)最低检测限考察；
[0027]图9为gyrA A90V最低检测限考察；
[0028]图10为gyrA D94G最低检测限考察；
[0029]图11为gyrA D94A最低检测限考察；
[0030]图12为gyrA D94N最低检测限考察。
具体实施方式
[0031]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产
品。
[0032]首先，本专利技术实施例提供了一种核酸组合物，其包括：核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示的引物对。
[0033]本专利技术提供的引物对覆盖了氟喹诺酮类药物耐基因gyrA基因的90和94两个氨基酸位点，可用于检测以下至少一种突变位点：gyrA A90V、gyrA D94G、gyrA D94A和gyrA D94N，相对于现有的其他引物组合而言，本专利技术的引物对具有更好的检测特异性和灵敏度。
[0034]在一些实施例中，所述核酸组合物还包括用于检测gyrA基因A90V、D94G、D94A和D94N中的至少一种突变位点的探针。
[0035]可选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0036]在一些实施例中，该探针的5
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端引入了1～5个与靶标序列不配对的碱基序列，使得DNA聚合酶无法水解5
’
翘尾探针，进而达到节约探针用量，提高荧光信号的目的。
[0037]优选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示。
[0038]本专利技术提供的探针可检测并区分gyrA基因A90V、D94G、D94A、D94N四种耐药突变，在3小时内快速鉴定结核分枝杆菌感染患者是否存在氟喹诺酮类药物耐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸组合物，其特征在于，其包括：核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示的引物对。2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物还包括用于检测gyrA基因A90V、D94G、D94A和D94N中的至少一种突变位点的探针；优选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；优选地，所述探针的5
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端有1～5个与靶标不配对的碱基序列；优选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4或5所示；优选地，所述探针的5
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端连接有荧光报告基团，3
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端连接有荧光淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团选自：5
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FAM、6
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FAM、HEX、TET、VIC、JOE、Cy3、Cy3.5、NED、TAMRA、ROX、Texas Red、Cy5、Cy5.5和Quasar670中的任意一种；优选地，所述荧光淬灭基团选自：TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB中的任意一种。3.根据权利要求1或2所述的核酸组合物，其特征在于，在所述引物对中，上游引物和下游引物的摩尔比为1：(1～10)。4.一种检测试剂，其特征在于，其包括权利要求1～3任一项所述的核酸组合物。5.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂用于检测结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药性或结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药基因突变。6.一种检测试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚宝，周慧玲，
申请(专利权)人：四川省亚中基因科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：