一种组成型启动子、黑曲霉中组成型启动子元件的筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种在黑曲霉中稳定表达的组成型启动子，所述组成型启动子包括ANI_1_974074即组蛋白H4启动子、ANI_1_58174即S

【技术实现步骤摘要】
一种组成型启动子、黑曲霉中组成型启动子元件的筛选方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程研究
，尤其是一种组成型启动子、黑曲霉中组成型启动子元件的筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]黑曲霉作为重要的工业发酵菌种，在蛋白表达、有机酸合成等方面有很好的工业应用前景。目前提升工业菌株性能的常用策略是通过代谢工程强化目标产物的合成途径。而启动子则是各种表达系统的基本元件，同时也是蛋白质表达载体的重要组成部分，它可以在转录阶段直接决定目的基因转录(表达)的起始时间和细胞内mRNA的浓度从而影响基因表达的强度。由于菌体内部物质和能量的代谢非常复杂，有时目的基因过量表达不仅不能使目的产物的产量增加，反而使菌体因代谢产物的过量积累负荷加重，底物缺乏，代谢失衡。因此，目的基因的适度表达往往会取得更好的效果，理想状态下，使用一系列强度合适的启动子可以间接地有效调控代谢流、代谢网络实现特定的目标。
[0003]目前在黑曲霉的代谢改造中已报道的组成型启动子元件有限，故本专利技术对黑曲霉自身启动子进行挖掘鉴定，期望筛选出更多的启动子元件，从而丰富基因表达原件库，为工程菌株的构建提供元件支持。
[0004]通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种组成型启动子、黑曲霉中组成型启动子元件的筛选方法和应用。
[0006]本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：
[0007]一种在黑曲霉中稳定表达的组成型启动子，所述组成型启动子包括ANI_1_974074即组蛋白H4启动子、ANI_1_58174即S
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(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶启动子、ANI_1_780184即假定蛋白启动子和ANI_1_1402034即L
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阿拉伯糖醇脱氢酶启动子。
[0008]进一步地，所述ANI_1_974074即组蛋白H4启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，ANI_1_58174即S
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(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，ANI_1_780184即假定蛋白启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，ANI_1_1402034即L
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阿拉伯糖醇脱氢酶启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.9。
[0009]进一步地，所述组成型启动子为不同强度的组成型启动子，参考已知组成型启动子PgpdA即3
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磷酸甘油醛脱氢酶、PpptA即npgA蛋白，启动子强度由强到弱排序为PgpdA>PpptA>ANI_1_974074(组蛋白H4)启动子>ANI_1_58174(S
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(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶)启动子>ANI_1_780184(假定蛋白)启动子>ANI_1_1402034(L
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阿拉伯糖醇脱氢酶)启动子。
[0010]进一步地，所述3
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磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA以及npgA蛋白基因启动子PpptA为控制基因转录的启动子。
[0011]进一步地，所述组成型启动子来源于黑曲霉、黄曲霉、米曲霉、大豆曲霉、烟曲霉基因组，但不限于其他曲霉相同基因的启动子序列，例如。来源于黄曲霉、米曲霉、大豆曲霉、烟曲霉的启动子序列与SEQ ID NO.6至SEQ ID NO.9的启动子序列相似性高于70％。
[0012]一种如权利要求1至5任一项所述的组成型启动子在黑曲霉中表达强度的评价方法，所述方法包括如下步骤：
[0013](1)对黑曲霉菌株S469提取RNA，进行转录组测序，根据转录组数据筛选在不同时间点下基因表达量稳定的基因，对依据转录组数据筛选出来的启动子基因根据FPKM值分组，挑选转录强度大于PgpdA的启动子基因、转录强度在PgpdA和PpptA之间的启动子基因以及转录强度小于PpptA的启动子基因，对筛选出的启动子进行q
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PCR验证，挑选转录水平差异小于1的基因，得到不同的启动子基因；
[0014](2)定点表达cexA基因框架载体质粒的构建，用筛选出的不同的启动子基因驱动柠檬酸转运蛋白cexA的表达；
[0015](3)将含有不同强度启动子表达载体的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S834共培养，获得含有不同强度启动子的黑曲霉菌株；
[0016](4)对含有所述表达载体的重组黑曲霉进行初步应用：将上述重组菌株于PDA固体培养基上培养5天，用无菌水将孢子冲洗下来，收集孢子计数，以2
×
106个/mL接种于50mL柠檬酸发酵培养基中，在28℃，220rpm培养3天，经样品制备后，利用HPLC法测定发酵液中柠檬酸的产量；同时收集菌体，用研钵将菌体粉碎，期间可加入液态氮气辅助研磨，参考RNA提取试剂盒FungalRNAKit(品牌：OMEGA，货号：R6840
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02)提取RNA，参考RNA反转录试剂盒RevertAidFirstStrandcDNASynthe发酵液离心取上清，sisKit反转录cDNA，以重组菌株cDNA为模板，验证在不同强度的组成型启动子下柠檬酸转运蛋白cexA的表达量。
[0017]进一步地，所述步骤(2)中柠檬酸转运蛋白cexA的序列在NCBI
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locus_tag是ANI_1_478154。
[0018]一种筛选在黑曲霉中稳定表达的不同强度组成型启动子基因的方法，筛选方法如下：
[0019](1)不同转录水平的启动子的筛选：
[0020]收集菌株S469(ΔoahA)的孢子，取1
×
108个孢子接种于50mL黑曲霉液体培养基中，28℃、200rpm培养，分别于不同的时间点进行取样，将菌体经纱布过滤，提取RNA，进行转录组测序，筛选出发酵过程不同时间点均稳定转录的168个基因，根据本领域已知的两个不同强度的启动子
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PgpdA启动子即3
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磷酸甘油醛脱氢酶启动子和PpptA启动子即npgA蛋白启动子，且PgpdA启动子强度高于PpptA启动子，以上述两个启动子强度为参考，将要选取的启动子分为三部分，即FPKM值高于PgpdA的启动子，FPKM值在PgpdA和PpptA之间的启动子，以及部分FPKM值在PpptA以下的启动子；对选取的启动子基因进行q
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PCR检测，根据结果，选取其基因转录差异倍数小于1的启动子，得到不同转录水平的启动子；
[0021](2)评估启动子转录强度，表达盒定点表达载体的构建，构建方法如下：
[0022]在pLH924(ΔamyA)的基础上，以ATCC1015基因组为模板，扩增cexA基因，将其定点插入到amyA位点构成框架载体pLH1099，即在酸性淀粉酶基因amyA位点定点表达cexA；之后在pLH1099的基础上，定点插入步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在黑曲霉中稳定表达的组成型启动子，其特征在于：所述组成型启动子包括ANI_1_974074即组蛋白H4启动子、ANI_1_58174即S
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(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶启动子、ANI_1_780184即假定蛋白启动子和ANI_1_1402034即L
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阿拉伯糖醇脱氢酶启动子。2.根据权利要求1所述的在黑曲霉中稳定表达的组成型启动子，其特征在于：所述ANI_1_974074即组蛋白H4启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，ANI_1_58174即S
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(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，ANI_1_780184即假定蛋白启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，ANI_1_1402034即L
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阿拉伯糖醇脱氢酶启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.9。3.根据权利要求1或2所述的在黑曲霉中稳定表达的组成型启动子，其特征在于：所述组成型启动子为不同强度的组成型启动子，参考已知组成型启动子PgpdA即3
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磷酸甘油醛脱氢酶、PpptA即npgA蛋白，启动子强度由强到弱排序为PgpdA>PpptA>ANI_1_974074(组蛋白H4)启动子>ANI_1_58174(S
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(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶)启动子>ANI_1_780184(假定蛋白)启动子>ANI_1_1402034(L
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阿拉伯糖醇脱氢酶)启动子。4.根据权利要求3所述的在黑曲霉中稳定表达的组成型启动子，其特征在于：所述3
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磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA以及npgA蛋白基因启动子PpptA为控制基因转录的启动子。5.根据权利要求1或2所述的在黑曲霉中稳定表达的组成型启动子，其特征在于：所述组成型启动子来源于黑曲霉、黄曲霉、米曲霉、大豆曲霉、烟曲霉基因组。6.一种如权利要求1至5任一项所述的组成型启动子在黑曲霉中表达强度的评价方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)对黑曲霉菌株S469提取RNA，进行转录组测序，根据转录组数据筛选在不同时间点下基因表达量稳定的基因，对依据转录组数据筛选出来的启动子基因根据FPKM值分组，挑选转录强度大于PgpdA的启动子基因、转录强度在PgpdA和PpptA之间的启动子基因以及转录强度小于PpptA的启动子基因，对筛选出的启动子进行q
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PCR验证，挑选转录水平差异小于1的基因，得到不同的启动子基因；(2)定点表达cexA基因框架载体质粒的构建，用筛选出的不同的启动子基因驱动柠檬酸转运蛋白cexA的表达；(3)将含有不同强度启动子表达载体的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S834共培养，获得含有不同强度启动子的黑曲霉菌株；(4)对含有所述表达载体的重组黑曲霉进行初步应用：将上述重组菌株于PDA固体培养基上培养5天，用无菌水将孢子冲洗下来，收集孢子计数，以2
×
106个/mL接种于柠檬酸发酵培养基中，在28℃，220rpm培养3天，经样品制备后，利用HPLC法测定发酵液中柠檬酸的产量；同时收集菌体...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘浩，申洁，朱洁，曹威，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：