一种细胞冻存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种细胞冻存液，包括终浓度为0.15

【技术实现步骤摘要】
一种细胞冻存液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]免疫治疗技术作为一种新兴的肿瘤治疗手段，具有杀瘤识别谱广、抗癌杀伤力高、毒副作用小等特点。免疫细胞类型主要有单核/巨噬细胞、CIK、NK等。
[0003]以自然杀伤细胞(NK)为例，它是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的粒状淋巴细胞，能通过自身表面活化性受体与肿瘤细胞表面配体之间的作用，可不受MHC分子的限制，进而识别MHC
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I类分子表达下调或缺失的肿瘤细胞，并发挥杀伤功能。由于NK细胞在外周血中仅占淋巴细胞的5％～15％，且肿瘤患者体内NK细胞的功能存在不同程度的缺失，导致难以产生良好的抗肿瘤效果，需要通过体外培养增加NK细胞的数量，以及不断增强NK细胞的杀伤功能等方法治疗。由于不能确保体外培养与临床使用时间节点的完全统一，故经常会出现因长时间培养而导致的成本增加、培养时间超过最佳对数生长期后细胞生长状态及活性的下降，从而影响NK细胞治疗效果的情况。
[0004]在现有技术中，主要是采用一种含不同比例的胎牛血清(FBS)、二甲基亚砜(DMSO)和RPMI
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1640的培养基的冻存液，来进行NK细胞体外培养后的保存，或是采用自体血清代替胎牛血清进行冻存。虽然前一种方法保存细胞的时间长，但是因为采用胎牛血清配制的冻存液，引入了外源蛋白，增加了病原污染的风险。而采用自体血清代替胎牛血清能够完全杜绝外源污染物感染的风险，但冻存后复苏培养的NK细胞活性较低。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种细胞冻存液及其制备方法和应用，能够用于免疫细胞冻存，保证细胞的活力和稳定性，配制好的细胞冻存液有效期为6个月以上，避免出现现配现用的冻存液对试剂的批次和安全难以控制的情况。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种细胞冻存液，所述细胞冻存液包括终浓度为0.15
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0.40mol/L的海藻糖、终浓度为0.41
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0.63mg/L的PEG、终浓度为65
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90mL/L的DMSO、终浓度为35
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65mL/L的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和基础培养基。
[0007]基础培养基包括RPMI1640溶液、MEM溶液、DMEM溶液、DMEM/F12溶液等。
[0008]优选的，所述细胞冻存液不含血清、人血白蛋白。
[0009]优选的，所述细胞冻存液包括终浓度为0.16mol/L的海藻糖、终浓度为0.43mg/L的PEG、终浓度为87.24mL/L的DMSO、终浓度为64.33mL/L的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和基础培养基。
[0010]优选的，所述细胞冻存液包括终浓度为0.25mol/L的海藻糖、终浓度为0.53mg/L的PEG、终浓度为76.02mL/L的DMSO、终浓度为50.87mL/L的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和基础培养基。
[0011]优选的，所述细胞冻存液包括终浓度为0.38mol/L的海藻糖、终浓度为0.61mg/L的
PEG、终浓度为66.26mL/L的DMSO、终浓度为37.47mL/L的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和基础培养基。
[0012]本专利技术还提供了一种细胞冻存液的制备方法，步骤如下：
[0013]S1、将海藻糖溶解于0.9％氯化钠注射液中，过滤，配成1mol/L无菌溶液；
[0014]S2、将PEG溶解于0.9％氯化钠注射液中，过滤，配成0.1g/L无菌溶液；
[0015]S3、按照一定浓度将步骤S1、S2所得的溶液与DMSO、甘油混合均匀，用基础培养基定容，即得。
[0016]优选的，所述过滤为0.22μm的一次性针式过滤器过滤。
[0017]本专利技术还提供了一种细胞冻存液在冻存细胞或制备冻存细胞的产品中的应用。
[0018]优选的，冻存细胞的产品是维持冻存复苏后细胞的活性或制备维持冻存复苏后细胞的活性的产品。
[0019]优选的，所述细胞冻存液在免疫细胞中的应用。
[0020]因此，本专利技术采用上述一种细胞冻存液及其制备方法和应用，能够维持细胞活率和细胞表型；并且，产品成分中不含血清、人血白蛋白，没有外源污染物感染的风险，保证了产品安全；同时，所用试剂便宜、制备简单，制造成本低，能进行批量生产。
[0021]下面通过实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0022]图1是本专利技术的实验测试中经细胞冻存液处理后的NK细胞活率变化趋势图；
[0023]图2是本专利技术的实验测试中经细胞冻存液处理前的NK细胞中CD3、CD56基因的流式结果图；
[0024]图3是本专利技术的实验测试中经含血清冻存液处理第1个月时的NK细胞中CD3、CD56基因的流式结果图；
[0025]图4是本专利技术的实验测试中经含血清冻存液处理第6个月时的NK细胞中CD3、CD56基因的流式结果图；
[0026]图5是本专利技术的实验测试中经无血清冻存液处理第1个月时的NK细胞中CD3、CD56基因的流式结果图；
[0027]图6是本专利技术的实验测试中经无血清冻存液处理第6个月时的NK细胞中CD3、CD56基因的流式结果图。
具体实施方式
[0028]以下通过实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0029]实施例一
[0030]一种不含血清的细胞冻存液，包括终浓度为0.16mol/L的海藻糖、终浓度为0.43mg/L的PEG、终浓度为87.24mL/L的DMSO、终浓度为64.33mL/L的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和RPMI1640溶液。
[0031]实施例二
[0032]一种不含血清的细胞冻存液，包括终浓度为0.25mol/L的海藻糖、终浓度为0.53mg/L的PEG、终浓度为76.02mL/L的DMSO、终浓度为50.87mL/L的甘油；所述细胞冻存液
的溶剂为0.9％氯化钠溶液和RPMI1640溶液。
[0033]实施例三
[0034]一种不含血清的细胞冻存液，包括终浓度为0.38mol/L的海藻糖、终浓度为0.61mg/L的PEG、终浓度为66.26mL/L的DMSO、终浓度为37.47mL/L的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和RPMI1640溶液。
[0035]对比例一
[0036]一种含血清的细胞冻存液，以体积百分比计，包括90％血清、10％DMSO。
[0037]实验测试
[0038]选取实施例一、二、三与对比例一中的细胞冻存液，其中冻存细胞为NK细胞，检测冻存液对NK细胞的活率与表面标志物的影响。步骤如下：
[0039]S1、采集脐血样本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞冻存液，其特征在于：所述细胞冻存液包括终浓度为0.15
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0.40mol/L的海藻糖、终浓度为0.41
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0.63mg/L的PEG、终浓度为65
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90mL/L的DMSO、终浓度为35
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65mL/L的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和基础培养基。2.根据权利要求1所述的一种细胞冻存液，其特征在于：所述细胞冻存液不含血清、人血白蛋白。3.根据权利要求1所述的一种细胞冻存液，其特征在于：所述细胞冻存液包括终浓度为0.16mol/L的海藻糖、终浓度为0.43mg/L的PEG、终浓度为87.24mL/L的DMSO、终浓度为64.33mL/L的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和基础培养基。4.根据权利要求1所述的一种细胞冻存液，其特征在于：所述细胞冻存液包括终浓度为0.25mol/L的海藻糖、终浓度为0.53mg/L的PEG、终浓度为76.02mL/L的DMSO、终浓度为50.87mL/L的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0....

【专利技术属性】
技术研发人员：李国喜，李霞云，范宇航，谷兆青，马思文，曹龙云，刘祥，李晓璇，
申请(专利权)人：唐颐惠康深圳生物医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：