一种基于生物素化抗溶菌酶金抗体的检测溶菌酶酶联免疫试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于金抗体的检测溶菌酶酶联免疫试剂盒及其应用。该生物素化抗溶菌酶金抗体可以同时结合溶菌酶和链霉亲和素，并将其应用于酶联免疫吸附法中检测鸡蛋清溶菌酶。该酶联免疫试剂盒包括：生物素化抗溶菌酶金抗体、包被有抗溶菌酶抗体的酶标板、酶标二抗、溶菌酶标准品、稀释液、显色液、洗涤液和终止液。本发明专利技术还公开了利用该试剂盒进行样品检测的方法。上述实施例试剂盒采用酶链免疫分析法中的夹心法原理，能对鸡蛋清中的溶菌酶进行定量检测。上述实施例试剂盒使用金抗体代替天然抗体进行检测，既具有更好的检测能力，也具有极佳的热稳定性，且兼具酶联免疫试剂盒的其他优点。他优点。他优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于生物素化抗溶菌酶金抗体的检测溶菌酶酶联免疫试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其是涉及一种基于金抗体的检测溶菌酶酶联免疫试剂盒及其应用，应用于溶菌酶定量检测


技术介绍

[0002]溶菌酶，也称为胞壁质酶或N
‑
乙酰胞壁质聚糖水解酶，广泛存在于细菌、噬菌体、真菌、植物和动物等多种生物体中。溶菌酶一级序列含有129个氨基酸，分子量为14400Da，它具有通过催化革兰氏阳性细菌细胞壁的N
‑
乙酰胞壁酸和N
‑
乙酰氨基葡萄糖肽聚糖残基之间的糖苷键水解来破坏细菌细胞膜的特性。溶菌酶较强的杀菌作用，较好的溶解性和较低的分子量使其在食品工业中被用作肉类、肉制品、鱼、鱼制品、牛奶、乳制品以及水果和蔬菜的防腐剂。但是，作为一种鸡蛋蛋白的溶菌酶也是一种常见的食物过敏原。
[0003]目前已经开发出了多种检测溶菌酶的方法，包括高效液相色谱、电化学生物传感器等，这些方法通常需要较长的样品处理时间、昂贵的仪器、复杂的测试过程。酶联免疫吸附法与这些方法相比，检测速度快、检测成本低，并且同样具备低检测限和高灵敏度。因此，开发快速、低成本的溶菌酶检测方法具有广泛的需求和广阔的前景。但是，作为酶联免疫吸附法核心的天然抗体，通常易受环境温度变化而失活，这也会在一定程度上限制酶联免疫吸附法的应用。生物素化抗溶菌酶金抗体是一种全新的通过构象工程而设计出的人工抗体，其不仅具有极佳的热稳定性，而且能够特异性结合溶菌酶和链霉亲和素两种蛋白，具有作为抗体替代物应用于酶联免疫吸附法的潜力。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术问题，本专利技术的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种基于金抗体的检测溶菌酶酶联免疫试剂盒及其应用，使用能够同时结合溶菌酶和链霉亲和素的生物素化抗溶菌酶金抗体，并且将其应用于酶联免疫试剂盒以检测待测样品中溶菌酶的含量，具有灵敏度高，特异性强，准确度高等优点。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种基于金抗体的检测溶菌酶酶联免疫试剂盒，包括生物素化抗溶菌酶金抗体、包被有抗溶菌酶抗体的酶标板、标记了链霉亲和素的辣根过氧化物酶(HRP
‑
SA)、溶菌酶标准品、稀释液、显色液、洗涤液和终止液。
[0007]优选地，使用生物素化抗溶菌酶金抗体，以酶联免疫夹心法对溶菌酶进行检测，具体方法步骤为：
[0008]抗溶菌酶抗体被预先包被在空白酶标板上，加入溶菌酶标准品以及生物素化抗溶菌酶金抗体，孵育5
‑
20min后，酶标板上会形成抗溶菌酶抗体
‑
溶菌酶
‑
生物素化抗溶菌酶金抗体，加入HRP
‑
SA，再加入辣根过氧化物酶的底物产生显色反应，反应5
‑
20min后，加入终止液终止反应，将酶标板放入酶标仪进行检测，得到不同浓度溶菌酶标准品对应的OD
450nm
值，
并绘制标准曲线，确定待测样品中溶菌酶的浓度。
[0009]一种本专利技术检测溶菌酶酶联免疫试剂盒的应用，用于实施检测溶菌酶的方法，包括如下步骤：
[0010](1)加入溶菌酶标准品及检测抗体：在酶标板上每孔加入20
‑
200μL不同浓度溶菌酶标准品以及20
‑
200μL生物素化抗溶菌酶金抗体，采用碳酸盐缓冲溶液作为稀释液，37℃孵育10
‑
60min，洗板并拍干；
[0011](2)加入酶标二抗：每孔加入20
‑
200μL的HRP
‑
SA，采用碳酸盐缓冲溶液作为稀释液，37℃孵育10
‑
60min，洗板并拍干；
[0012](3)显色:加入每孔20
‑
200μL底物显色液，37℃避光孵育10
‑
40min，加入终止液终止反应；
[0013](4)检测分析:使用多功能酶标仪，测定每孔的信号值OD
450nm
，分析检测结果，以x轴为溶菌酶浓度，y轴为450nm处的OD值，绘制检测溶菌酶的标准曲线。
[0014]优选地，稀释液为pH为7
‑
11的缓冲溶液。进一步优选稀释液为pH为7
‑
11的磷酸盐缓冲溶液或碳酸盐缓冲溶液。
[0015]优选地，底物显色液为四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)。
[0016]优选地，终止液采用硫酸或盐酸，终止液的酸浓度不大于2M。
[0017]本专利技术与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
[0018]1.本专利技术检测溶菌酶的酶联免疫试剂盒使用生物素化抗溶菌酶金抗体作为天然抗体的替代物，不仅具有更高的检测范围和更低的检测限，而且避免了天然抗体易受温度变化而失活的缺点；
[0019]2.本专利技术采用酶联免疫吸附法中的夹心法原理，可以准确定量待测样品中溶菌酶的含量；本专利技术试剂盒使用生物素化抗溶菌酶金抗体代替天然抗体进行检测，既具有更好的检测能力，也具有极佳的热稳定性，且兼具酶联免疫试剂盒的其他优点。
附图说明
[0020]图1为本专利技术优选实施例检测溶菌酶的原理示意图。
[0021]图2为本专利技术优选实施例检测溶菌酶的标准曲线。
[0022]图3为本专利技术优选实施例检测溶菌酶时加入核糖核酸酶A的标准曲线。
具体实施方式
[0023]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]本专利技术优选实施例使用了公开号为CN105884888A的专利文献公开的，根据cAb
‑
Lys3的CDR3的多肽片段设计的Pep1，通过S
‑
Au键嫁接到金纳米粒子上，制备出与天然抗体相同特异性的抗溶菌酶金抗体。在此基础上，使用了生物素化抗溶菌酶金抗体，通过投加标记了巯基聚乙二醇的生物素，将抗溶菌酶金抗体生物素化，使其具有同时结合溶菌酶和链霉亲和素的能力。
[0025]本专利技术优选实施例使用上述生物素化抗溶菌酶金抗体，按照酶联免疫分析法中的夹心法原理对溶菌酶进行检测。如图1所示，其检测原理为：抗溶菌酶抗体预先包被在孔板上，如图1A所示，加入溶菌酶标准品和生物素化抗溶菌酶金抗体并孵育一段时间，此时孔板上会出现抗溶菌酶抗体
‑
溶菌酶
‑
生物素化抗溶菌酶金抗体的夹心结构，如图1中的B部分，再加入酶标二抗后，标记了链霉亲和素的辣根过氧化物酶会与生物素化抗溶菌酶金抗体结合，如图1中的C部分，利用辣根过氧化物酶与其底物的酶促反应，孔板上的吸光值OD
450nm
与溶菌酶的浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于金抗体的检测溶菌酶酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括生物素化抗溶菌酶金抗体、包被有抗溶菌酶抗体的酶标板、标记了链霉亲和素的辣根过氧化物酶(HRP
‑
SA)、溶菌酶标准品、稀释液、显色液、洗涤液和终止液。2.根据权利要求1所述检测溶菌酶酶联免疫试剂盒，其特征在于：使用生物素化抗溶菌酶金抗体，以酶联免疫夹心法对溶菌酶进行检测，具体方法步骤为：抗溶菌酶抗体被预先包被在空白酶标板上，加入溶菌酶标准品以及生物素化抗溶菌酶金抗体，孵育5
‑
20min后，酶标板上会形成抗溶菌酶抗体
‑
溶菌酶
‑
生物素化抗溶菌酶金抗体，加入HRP
‑
SA，再加入辣根过氧化物酶的底物产生显色反应，反应至少5
‑
20min后，加入终止液终止反应，将酶标板放入酶标仪进行检测，得到不同浓度溶菌酶标准品对应的OD
450nm
值，并绘制标准曲线，确定待测样品中溶菌酶的浓度。3.一种权利要求1所述检测溶菌酶酶联免疫试剂盒的应用，用于实施检测溶菌酶的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹傲能，李文浩，王海芳，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：