一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物制品技术领域，公开了一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用，所述试剂盒组分包括：2

【技术实现步骤摘要】
L858R突变位点、EGFR 19del突变位点、EGFR L861Q突变位点、EGFR C797S突变位点、EGFR G719突变位点、MET基因拷贝数变异、ERBB2基因拷贝数变异，所述引物探针反应液中各引物探针的浓度为0.1μM～0.5μM；
[0009]所述扩增反应使用数字PCR技术，其反应体系试剂选用2
×
ddPCR Supermix、引物探针反应液以及样本，其中所述2
×
ddPCR Supermix使用量为11μL，所述引物探针反应液使用量为4μL，所述样本使用量为7μL，各反应试剂总体积为22μL；
[0010]所述扩增反应体系步骤包括：
[0011](1)预变性设置温度95℃，时间设为10min，循环数1cycle；
[0012](2)变性设置温度94℃，时间设为30s，循环数40cycle；
[0013](3)退火延伸设置温度55℃，时间设为60s，循环数40cycle；
[0014](4)保温设置温度98℃，时间设为10min，循环数1cycle；
[0015](5)保温设置温度4℃，时间设为无限，循环数0；
[0016]其中PCR仪热盖温度105℃，体积为40uL，温度仪调节速率为2℃/s。
[0017]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述EGFR T790M突变位点引物探针名称分别设为T790M
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F1、T790M
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R1、T790M
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MT
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P1和T790M
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WT
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P2。
[0018]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述EGFR L858R突变位点引物探针名称分别设为L858R
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F1、L858R
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R1、L858R
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MT
‑
P1和L858R
‑
WT
‑
P2。
[0019]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述EGFR 19del突变位点引物探针名称分别设为19del
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F1、19del
‑
R1、19del
‑
MT
‑
P1和19del
‑
WT
‑
P2。
[0020]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述EGFR L861Q突变位点引物探针名称分别设为L861Q
‑
F1、L861Q
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R1、L861Q
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MT
‑
P1和L861Q
‑
MT
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P2。
[0021]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述EGFR C797S突变位点引物探针名称分别设为C797S
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F1、C797S
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R1、C797S
‑
MT
‑
P1和C797S
‑
WT
‑
P2。
[0022]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述EGFR G719突变位点引物探针名称分别设为G719
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F1、G719
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R1、G719
‑
WT
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P1、G719S
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P1、G719C
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P1和G719A
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P1。
[0023]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述MET基因拷贝数变异引物探针名称分别设为MET
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F1、MET
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R1、EIF2C1
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F1、MET
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P1、EIF2C1
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F1、EIF2C1
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R1和EIF2C1
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P1。
[0024]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述ERBB2基因拷贝数变异引物探针名称分别设为ERBB2
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F1、ERBB2
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R1、ERBB2
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P1、CEP17
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F1、CEP17
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R1和CEP17
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P1。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0026]1、本专利技术使用数字PCR技术，对比现有其他检测技术，操作简便快速，不需要构建标准曲线，定量准确，灵敏度更高，使用样本量更少且抗干扰能力更强；
[0027]2、本专利技术对比同类基于微滴式数字PCR技术的试剂盒，本试剂盒覆盖的检测位点更加全面，一次检测可以覆盖多种基因多种突变且体系可以在同样的程序下扩增，操作更为简单快捷。
[0028]3、本专利技术对比其他方法，本产品适用的样本类型更为广泛，对样本要求低，样本获取简单。
附图说明
[0029]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0030]图1为本专利技术一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用的T790M突变位点引物探针序列验证结果；
[0031]图2为本专利技术一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒的EGFR T790M突变位点反应体系优化结果；
[0032]图3为本专利技术一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用的EGFR T790M突变位点反应程序优化结果；
[0033]图4为本专利技术一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用的T790M突变阳性临床样本和阴性临床样本检测结果；
[0034]图5为本专利技术一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用的L858R突变阳性临床样本和阴性临床样本检测结果；
[0035]图6为本专利技术一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用的19Del突变阳性临床样本和阴性临床样本检测结果；
[0036]图7为本专利技术一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用的L861Q突变阳性临床样本和阴性临床样本检测结果；
[0037]图8为本专利技术一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用的C797S突变阳性临床样本和阴性临床样本检测结果；
[0038]图9为本专利技术一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用的G719突变阳性临床样本和阴性临床样本检测结果；
[0039]图10为本专利技术一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用的MET基因拷贝数变异阳性样本临床样本检测结果；
[0040]图11为本专利技术一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用的ERBB2基因拷贝数变异阳性样本临床样本检测结果。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用，其特征在于，所述试剂盒组分包括：2
×
ddPCRSupermixfor Probes；所述引物探针反应液采用八连管装，八组引物探针反应液各管孔位可分为A～H，且各孔位对应突变类型分别为：EGFRT790M、EGFRL858R、EGFR19del、EGFRL861Q、EGFRC797S、EGFRG719、MET扩增和HER2扩增；所述突变位点可根据物探针反应液类型分别设置为EGFRT790M突变位点、EGFRL858R突变位点、EGFR19del突变位点、EGFRL861Q突变位点、EGFRC797S突变位点、EGFRG719突变位点、MET基因拷贝数变异、ERBB2基因拷贝数变异，所述引物探针反应液中各引物探针的浓度为0.1μM～0.5μM；所述扩增反应使用数字PCR技术，其反应体系试剂选用2
×
ddPCR Supermix、引物探针反应液以及样本，其中所述2
×
ddPCRSupermix使用量为11μL，所述引物探针反应液使用量为4μL，所述样本使用量为7μL，各反应试剂总体积为22μL；所述扩增反应体系步骤包括：(1)预变性设置温度95℃，时间设为10min，循环数1cycle；(2)变性设置温度94℃，时间设为30s，循环数40cycle；(3)退火延伸设置温度55℃，时间设为60s，循环数40cycle；(4)保温设置温度98℃，时间设为10min，循环数1cycle；(5)保温设置温度4℃，时间设为无限，循环数0；其中PCR仪热盖温度105℃，体积为40uL，温度仪调节速率为2℃/s。2.根据权利要求1所述的一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用，所述EGFRT790M突变位点引物探针名称分别设为T790M
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F1、T790M
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R1、T790M
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MT
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P1和T790M
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WT
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P2。3.根据权利要求1所述的一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用，所述EGFRL858R突变位点引物探针名称分别设为L858R
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F1、L858R
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R1、L858R
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MT
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P1和L858R
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WT
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P2。4.根据权利要求1所述的一种基于微滴式数字PCR技术的组合检测多种基因突变的试剂盒及其应用，所述EGFR19del突变位点引物探...

【专利技术属性】
技术研发人员：任黎明，孙克茂，李娅婕，张惠丹，
申请(专利权)人：苏州乾康基因有限公司，
类型：发明
国别省市：