一种制备他克莫司脂质体的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备他克莫司脂质体的方法，包括以下步骤：步骤(1)、取他克莫司菌株产生菌孢子悬浮液，接种于种子培养基上，在26

【技术实现步骤摘要】
一种制备他克莫司脂质体的方法


[0001]本专利技术属于生物制药
，更具体涉及一种制备他克莫司脂质体的方法。

技术介绍

[0002]他克莫司的分子式为C
44
H
69
NO
12
·
H2O，分子量：822.03。他克莫司的化学结构式如下所示：
[0003][0004]他克莫司(Tacro l imus)又名FK
‑
506，是从Streptomyces tacro l imi cus代谢产物中提取的一种大环内酯类免疫抑制剂。在分子水平，他克莫司利用与细胞性蛋白质(FKBP12)相结合，而在细胞内蓄积产生效用。FKBP12
‑
他克莫司复合物会专一性地结合以及抑制ca l c i nur i n，其会抑制T细胞中所产生钙离子依赖型讯息传导路径作用，因此防止不连续性淋巴因子基因的转录。他克莫司具有高度免疫抑制，其活性在体外及体内实验中都已被证实。他克莫司抑制形成主要移植排斥作用之细胞毒性淋巴球的生成；抑制T细胞的活化作用以及T辅助细胞依赖B细胞的增生作用；也能抑制如白介素
‑
2、白介素
‑
3及γ
‑
干扰素等淋巴因子的生成与白介素
‑
2受体的表达。
[0005]他克莫司的适应症为预防肝脏或肾脏移植术后的移植排斥反应，但是其对神经系统、呼吸系统、泌尿系统等均有一定的副作用。因此，如何降低药物对人体的副反应，成为一个技术壁垒。
专利技术内容
[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供一种从他克莫司菌株制备他克莫司脂质体的方法，该方法具有制备路线短，操作程序简单，制造成本较低的优点。
[0007]本专利技术公开了一种制备他克莫司脂质体的方法，该方法包括以下步骤：
[0008]步骤(1)、取他克莫司菌株产生菌孢子悬浮液，接种于种子培养基上，在26
‑
28℃下培养2
‑
4天；
[0009]步骤(2)、种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，26
‑
28℃下发酵40
‑
48小时，加入大孔吸附树脂，发酵5
‑
8天，发酵完成后进行放罐；
[0010]步骤(3)、发酵液中树脂进行漂洗，漂洗后装柱洗脱，洗脱液浓缩；
[0011]步骤(4)、浓缩液经过反相C18填料进行制备纯化，流动相为甲醇或乙腈水溶液，得到的纯化液经过浓缩析晶；
[0012]步骤(5)、将步骤(4)的晶体与磷脂、胆固醇，在水浴中溶解于适量乙醇中，减压蒸发至干成膜；加入pH6.5的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，旋转使其充分混合使膜溶解，超声，滤膜过滤，得到他克莫司脂质体。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0014]在本专利技术中，将他克莫司菌株经过培养后得到的发酵液经过纯化处理，用薄膜法制成他克莫司脂质体，具有制备路线短，操作程序简单，制造成本较低的优点。
附图说明
[0015]图1为本专利技术实例一的制备图；
[0016]图2为本专利技术实例二的制备图；
[0017]图3为本专利技术实例一的制备图；
[0018]图4为本专利技术实例一的制备图；
[0019]图5为本专利技术实例一的制备图；
[0020]图6为本专利技术实例一至实例五制得的他克莫司脂质体包封率的图。
具体实施方式
[0021]下面结合各实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本专利技术的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本专利技术的保护范围之内。除非说明书中有特殊说明，本专利技术中组分、原料均采用化学纯级别。
[0022]另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“hr”为时间单位“小时”；“ml”为体积单位“毫升”；“L”为体积单位“升”；“r”为单位“转数”；“min”为时间单位“分钟”。
[0023]实例一
[0024]本实施例公开了一种自他克莫司菌株制备他克莫司脂质体的方法，该方法包括以下步骤：
[0025]步骤(1)、取他克莫司产生菌孢子悬液，接种于种子培养基上，28℃下培养2天。该种子培养基中的各组分为(单位：g/L)：酵母抽提物5，葡萄糖20，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾1，碳酸钙1，余量为水。
[0026]步骤(2)、种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，26℃培养8天。发酵培养基中的各组分(单位：g/L)：酵母抽提物15，玉米糊精65，葡萄糖15，蔗糖20，玉米浆干粉55，碳酸钙1，蛋氨酸2，磷酸二氢钾0.5，磷酸氢二钾0.5，余量为水。发酵40hr加入发酵液体积
0.5％大孔吸附树脂D
‑
101,发酵完毕后进行放罐。
[0027]步骤(3)、发酵液中树脂进行漂洗，漂洗后装柱洗脱，洗脱液为35％的甲醇水溶液，洗脱体积为4倍树脂体积。洗脱液进行减压浓缩
[0028]步骤(4)、浓缩液经过填料YMC Gel Pro C18进行制备纯化，制备柱为150mm*250mm，流速为200ml/min，流动相为45％甲醇水溶液，得到的纯化液在50℃进行浓缩析晶。制备图如图1所示。
[0029]步骤(5)、将步骤(4)所得晶体与一定量的卵磷脂、胆固醇(卵磷脂与胆固醇的比例为10：1)在水浴中溶解于适量乙醇中，减压蒸发温度45℃，真空度为0.08MPa，成膜后加入pH6.5的磷酸缓冲盐溶液(PBS)40ml，旋转速度为12r/min，使其充分混合使膜溶解，超声，滤膜过滤，得到他克莫司脂质体。
[0030]实例二
[0031]本实施例公开了一种自他克莫司菌株制备他克莫司脂质体的方法，该方法包括以下步骤：
[0032]步骤(1)、取他克莫司产生菌孢子悬液，接种于培养基上，26℃下培养3天；该种子培养基中的各组分为(单位：g/L)：酵母抽提物10，葡萄糖40，玉米浆干粉15，磷酸二氢钾1，碳酸钙1，余量为水。
[0033]步骤(2)、种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，28℃培养5天。发酵培养基中的各组分为(单位：g/L)：酵母抽提物25，玉米糊精65，葡萄糖20，蔗糖25，玉米浆干粉50，碳酸钙2，蛋氨酸3，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾1，余量为水。发酵44hr加入发酵液体积1.2％大孔吸附树脂HPD
‑
100,发酵完毕后进行放罐。
[0034]步骤(3)、发酵液中树脂进行漂洗，漂洗后装柱洗脱，洗脱液为45％的乙醇水溶液，洗脱体积为4倍树脂体积。洗脱液进行减压浓缩。
[0035]步骤(4)、浓缩液经过填料YMC Gel Pro C18进行制备纯化，制备柱为150mm*250mm，流速为250ml/min，流动相为55％乙腈水溶液，得到的纯化液在50℃进行浓缩析晶。制备图如图2所示。
[0036]步骤(5)、将步骤(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备他克莫司脂质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)、取他克莫司菌株产生菌孢子悬浮液，接种于种子培养基上，在26
‑
28℃下培养2
‑
4天；步骤(2)、种子培养基接种于发酵罐内并添加发酵培养基，26
‑
28℃下发酵40
‑
48小时，加入大孔吸附树脂，发酵5
‑
8天，发酵完成后进行放罐；步骤(3)、发酵液中树脂进行漂洗，漂洗后装柱洗脱，洗脱液浓缩；步骤(4)、浓缩液经过反相C18填料进行制备纯化，流动相为甲醇或乙腈水溶液，得到的纯化液经过浓缩析晶；步骤(5)、将步骤(4)的晶体与磷脂、胆固醇，在水浴中溶解于适量乙醇中，减压蒸发至干成膜；加入pH6.5的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，旋转使其充分混合使膜溶解，超声，滤膜过滤，得到他克莫司脂质体。2.根据权利要求1所述的一种制备他克莫司脂质体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的种子培养基的组成为：酵母抽提物5
‑
15g/L，葡萄糖20
‑
40g/L，玉米浆干粉5
‑
15g/L，磷酸二氢钾1
‑
3g/L，碳酸钙1
‑
3g/L。3.根据权利要求2所述的一种制备他克莫司脂质体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的发酵培养基的组成为：酵母抽提物15
‑
25g/L，玉米糊精45<...

【专利技术属性】
技术研发人员：付静，游云龙，史佳栋，金丹甜，
申请(专利权)人：无锡福祈制药有限公司，
类型：发明
国别省市：