一种HPLC检测植物游离多胺的方法技术

本发明专利技术公开了一种HPLC检测植物游离多胺的方法，所述方法能将植物样品中的目标物腐胺(Put)、亚精胺(Spd)、热精胺(T

【技术实现步骤摘要】
一种HPLC检测植物游离多胺的方法


[0001]本专利技术涉及游离多胺的检测
，具体地，涉及一种HPLC检测植物游离多胺的方法。

技术介绍

[0002]多胺(Polyamines，PAs)是一类含有两个或两个以上氨基的高活性小分子脂肪族化合物，广泛分布在原核生物和真核生物中。腐胺(Putrescine，Put)、亚精胺(Spermidine，Spd)和精胺(Spermine，Spm)是植物体内最常见且较早被发现的多胺。
[0003]根据分子结构中氨基的数量，常见多胺可分为二胺(即Put)，三胺(即Spd)和四胺(即Spm和T
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Spm)。热精胺(Thermospermine，T
‑
Spm)是Spm的结构异构体，首先在嗜热菌(Thermus thermophilus)中被分离出来，后来发现T
‑
Spm在高等植物中也是普遍存在的。
[0004]研究表明，PAs以游离形式或与肉桂酸等小分子结合的形式广泛参与植物生命活动过程，如DNA合成、细胞分裂、维管发育、花粉发育、籽粒大小发育、果实成熟、衰老、逆境响应等。因此，精确测定植物体内多胺含量在研究植物生长发育中至关重要。
[0005]目前，在拟南芥中关于游离多胺含量测定方法已有相关报道，其中，拟南芥中多胺含量测定的HPLC程序见表1(PMID:24906355)：
[0006]表1，拟南芥中使用HPLC检测多胺的运行程序
[0007][0008]目前在拟南芥中分离游离多胺多数使用乙腈和水作为流动相，但该方法有分离时间较长，流动相成本高，使用乙腈的量大导致有机废液较多，增加了废液的回收成本以及对环境存在污染等缺点。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种HPLC检测植物游离多胺的方法。
[0010]本专利技术的第一个目的是提供一种HPLC检测植物游离多胺的样品前处理的方法。
[0011]本专利技术的第二个目的是提供一种HPLC检测植物游离多胺的方法。
[0012]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0013]本新方法使用甲醇和水作为流动相，通过不断调整HPLC的运行程序，得出了以下
最优甲醇和水的配比，以及目标物的保留时间等。该新方法分离时间缩短了近一半，流动相使用量减半，大大降低了运行成本，且降低了废液的回收成本和对环境污染的可能性。具体运行程序见表2。
[0014]表2用HPLC检测多胺的运行程序：
[0015][0016]因此本专利技术要求保护一种HPLC检测植物游离多胺的样品前处理的方法，包括以下步骤：
[0017]S1.待测样品液氮中研磨为粉末，与高氯酸水溶液充分混合，匀浆之后固液分离，取上清液，去除杂质；
[0018]S2.步骤S1得到的上清液与NaOH溶液充分混合后，再与苯甲酰氯充分混合；之后与NaCl溶液充分混合；之后与乙醚充分混合；固液分离，取上清液；
[0019]S3.取步骤S2得到的上清液，去除溶剂，干燥后，与甲醇混合，去除杂质，得到样品提取液。
[0020]优选地，步骤S1中，每克样品加500μL 5％～10％(v/v)高氯酸(PCA)水溶液。
[0021]更优选地，步骤S1中，每克测样品加500μL 5％(v/v)PCA。
[0022]优选地，步骤S2中，NaOH溶液浓度为2～3M，NaCl溶液浓度为2～3M，NaOH溶液、苯甲酰氯、NaCl和乙醚的体积比为：1～1.5mL：10～15μL：1～1.5mL：2～3mL。
[0023]更优选地，步骤S1中，NaOH溶液浓度为2M，NaCl溶液为饱和NaCl溶液，NaOH溶液、苯甲酰氯、饱和NaCl和乙醚的体积比为：1mL：10μL：2mL：2mL。
[0024]优选地，步骤S3中，上清液与甲醇的体积比为：5～7：1。
[0025]更优选地，步骤S3中，上清液与甲醇的体积比为：6：1。
[0026]本专利技术还要求保护一种HPLC检测植物游离多胺的方法，使用任一所述方法进行样品前处理，得到样品提取液；使用HPLC检测样品提取液游离多胺的含量。
[0027]优选地，使用SB
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C18反向色谱柱。
[0028]更优选地，所述SB
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C18反向色谱柱为ZORBAX SB
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C18反向色谱柱。
[0029]优选地，HPLC检测采用梯度洗脱，所述梯度洗脱按以下程序进行：
[0030]第0到2min，流动相中水的体积占比由60％下降到40％，甲醇的体积占比由40％上升到60％
[0031]第2到22min，流动相中水的体积占比由40％下降到30％，甲醇的体积占比由60％上升到70％，
[0032]第22到24.5min，流动相中水的体积占比由30％下降0％，甲醇的体积占比由70％上升到100％，
[0033]第24.5到28min，流动相中水的体积占比由0％上升到40％，甲醇的体积占比由100％下降到60％，
[0034]第28到35min，流动相中水的体积占比为40％，甲醇的体积占比为60％。
[0035]优选地，柱温25～30℃。
[0036]更优选地，柱温30℃。
[0037]优选地，所述多胺为腐胺、亚精胺、热精胺和/或精胺的一种或几种。
[0038]优选地，所述植物为番茄或水稻。
[0039]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0040]1，分离能力强：能将植物样品中的目标物腐胺(Put)，亚精胺(Spd)，热精胺(T
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Spm)以及精胺(Spm)清晰的分离开。其中，由于T
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Spm和Spm都属于四胺异构体，分子结构非常相似，也很难被成功分离开。使用乙腈和水作为流动相能勉强分离开这两个四胺，但仍然可见这两个目标峰彼此连接，说明分离效果并非十分理想。本专利的新方法对T
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Spm和Spm的分离比目前普遍使用的乙腈和水作为流动相更加清晰，能清晰分离开T
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Spm和Spm。
[0041]2，实验成本低：降低了实验成本，分离时间缩短一半，流动相使用量减半，大大降低了运行成本(流动相的购买成本和HPLC的使用成本均减半)。
[0042]3，实验周期短：实验时间缩短了一半，为研究人员节约了宝贵时间。
[0043]4，运行稳定，数据可靠：本专利技术的方法分离目标物的保留时间稳定，从不同样品中分离得到的目标物与标样对应的峰能很好的重叠，数据清楚，结果可靠。
[0044]5，保护环境：更加环保，运行时间减半，流动相使用量减半，废液减半，废液的回收成本亦减半，减少了对环境污染的潜在污染。
附图说明
[0045]图1实施例2中HPLC检测不同番茄游离多胺的方法的结果；A为多胺标准品(含Put、Spd本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HPLC检测植物游离多胺的样品前处理的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.待测样品液氮中研磨为粉末，与高氯酸水溶液充分混合，匀浆之后固液分离，取上清液，去除杂质；S2.步骤S1得到的上清液与NaOH溶液充分混合后，再与苯甲酰氯充分混合；之后与NaCl溶液充分混合；之后与乙醚充分混合；固液分离，取上清液；S3.取步骤S2得到的上清液，去除溶剂，干燥后，与甲醇混合，去除杂质，得到样品提取液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，每克样品加500μL 5％～10％(v/v)高氯酸水溶液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，NaOH溶液浓度为2～3M，NaCl溶液浓度为2～3M，NaOH溶液、苯甲酰氯、NaCl和乙醚的体积比为：1～1.5mL：10～15μL：1～1.5mL：2～3mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，上清液与甲醇的体积比为：5～7：1。5.一种HPLC检测植物游离多胺的方法，其特征在于，使用权利要求1到5任一所述方法进行样品前处理，得到样品提取液；使用HPLC检测样品提取液游离多胺的含量。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘太波，庞港，潘璐怡，麦华富，秦湉，韦欢，梁芷曼，倪坚胜，唐海莹，谢穗恩，郑芃芃，陈芝洁，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：