用于核酸测序的方法和组合物技术

本公开的实施方案涉及用于使用蓝光激发和紫光激发(例如，分别为450

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸测序的方法和组合物


[0001]本公开大体上涉及用于核酸测序应用的方法、系统、试剂盒和组合物。

技术介绍

[0002]对于DNA测序而言，希望采用多个光谱上可区分的荧光标记，以实现对多个空间重叠分析物的独立检测。在此类多重方法中，可以减少反应容器的数量，从而简化实验方案并且促进专用试剂盒的生产。例如，在多色自动化DNA测序系统中，多重荧光检测允许在单个电泳通道中分析多个核苷酸碱基，从而通过单色方法提高吞吐量，并且降低与通道间电泳迁移率变化相关的不确定性。
[0003]然而，多重荧光检测可能存在问题，并且存在的许多重要因素会限制适当荧光标记的选择。首先，在给定的应用中可能难以找到具有基本上分辨的吸收和发射光谱的染料化合物。另外，当若干荧光染料一起使用时，通过同时激发在可区分光谱区域中产生荧光信号可能是复杂的，因为这些染料的吸收带通常很分开，所以即使是两种染料也难以达到相当的荧光激发效率。许多激发方法使用高功率光源，如激光器，因此染料必须具有足够的光稳定性以承受此类激发。对分子生物学方法特别重要的最后一个考虑因素是荧光染料必须与试剂化学性质相容的程度，诸如DNA合成溶剂和试剂、缓冲液、聚合酶和连接酶。
[0004]具有改进的荧光特性(诸如合适的荧光强度、形状和荧光带的波长最大值)的荧光染料分子可以提高核酸测序的速度和准确性。当在水基生物缓冲液中并且在较高温度下进行测量时，强荧光信号尤其重要，因为大多数有机染料的荧光强度在此类条件下显著较低。此外，染料所附接的碱基的性质也影响荧光最大值、荧光强度和染料的其他光谱特性。核碱基与荧光染料之间的序列特异性相互作用可以通过荧光染料的特异性设计来定制。荧光染料结构的优化可以提高核苷酸掺入的效率、降低测序误差的水平，并且减少核酸测序中试剂的使用，从而降低核酸测序的成本。
[0005]一些光学和技术的开发已引起图像质量的极大改善，但是最终受到光学分辨率差的限制。光学分辨率由Abbe定律决定。一般来讲，光学显微镜法的光学分辨率限于以所使用的光的波长的大约一半间隔开的对象。实际上，只有相距相当远(至少200nm至350nm)的对象才可以通过光学显微镜法分辨。提高图像分辨率并且增加每单位表面积的可分辨对象数量的一种方法是使用较短波长的激发光。例如，如果用相同的光学器件将光波长缩短Δλ约100nm，则分辨率将更好(约Δ50nm/(约15％))，将记录较少失真的图像，并且可识别区域上的对象的密度将增加约35％。
[0006]然而，强烈的激光辐照(尤其是蓝色或紫色区域的较短波长)可能会漂白荧光染料和损坏溶液中/流通池表面上的核苷酸样品或与荧光染料缀合的那些核苷酸样品。此类暴露于光中也可能引起DNA样品损伤。光漂白和光损伤的类型和程度可以根据例如化合物的化学结构和它们的一些物理化学特性(如氧化还原电位、特定生物标记的激发光谱、特定光源辐照的强度和在特定测量中暴露的时间)而变化。由于较低波长的光源输送更高的能量光子，因此具有较短波长的紫色LED/激光器更容易引起染料的光漂白和DNA损伤。在荧光检
测中存在许多化学途径，通过这些化学途径可能会在辐照期间引起核酸损伤。例如，已经表明暴露于紫外线(UV)辐射可以经由胸腺嘧啶或胞嘧啶的直接光化学[2+2]光环加成反应提供含有融合嘧啶二聚体(诸如TT、TC和CC)的环丁烷，从而引起DNA损伤。此类直接光环加成反应可以发生在从约100nm起延伸至约315nm的UV B区域和UV C区域中。在穿过可见光区域的一部分(从约315nm起跨至约500nm)的UV A区域中，间接机制的复杂混合物也可以通过其他组分的光敏作用引起DNA损伤。此类间接机制可以经由与不同的光诱导活性物质(例如，活性氧物质(ROS)(诸如单态氧、超氧阴离子和羟基自由基))相互作用导致氧化DNA修饰。
[0007]为了增加测序效率并降低每个基因组的成本，必需增加节距密度，使得可以在相同的所需表面积中填充更多的簇，同时维持良好的光学分辨率，这需要使用具有较短波长(诸如紫色和蓝色激光器)的光。在用于核酸测序应用的非常拥挤的波长区域(蓝色至紫色区域)中选择适当的染料集合并减轻由较短波长激发引起的DNA损伤仍存在挑战。

技术实现思路

[0008]本公开涉及用于使用蓝光激发和紫光激发(例如，在450
‑
460nm和400
‑
405nm处的激光)进行两通道核酸测序应用的方法、试剂盒和组合物。
[0009]本公开的一些方面涉及一种用于确定靶多核苷酸的序列的方法，其包括：
[0010](a)使引物多核苷酸与包含第一类型的核苷酸、第二类型的核苷酸、第三类型的核苷酸和第四类型的核苷酸中的一种或多种的混合物接触，其中引物多核苷酸与靶多核苷酸的至少一部分互补；
[0011](b)将来自混合物的一种类型的核苷酸掺入到引物多核苷酸中以产生延伸的引物多核苷酸；
[0012](c)使用第一激发光源执行第一成像事件并且使用第一发射滤光器收集来自延伸的引物多核苷酸的第一发射信号；以及
[0013](d)使用第二激发光源执行第二成像事件并且使用第二发射滤光器收集来自延伸的引物多核苷酸的第二发射信号；
[0014]其中第一激发光源和第二激发光源中的一者具有约350nm至约410nm的波长，并且第一激发光源和第二激发光源中的另一者具有约450nm至约460nm的波长；并且
[0015]其中第一发射滤光器和第二发射滤光器中的一者具有约415nm至约450nm的检测波长，并且第一发射滤光器和第二发射滤光器中的另一者具有约480nm至约525nm的检测波长。在一些实施方案中，第一类型的核苷酸、第二类型的核苷酸和第三类型的核苷酸中的每一者用可检测标记标记。在其他实施方案中，第一类型的核苷酸、第二类型的核苷酸和第三类型的核苷酸中的一种或多种是未标记的，并且方法利用第二标记步骤，该第二标记步骤涉及使用特异性结合到掺入到引物多核苷酸/靶多核苷酸复合物中的未标记核苷酸的一种或多种亲和试剂。在另外的实施方案中，第四类型的核苷酸是未标记的并且在第一成像事件和第二成像事件期间不发射任何信号。
[0016]本公开的一些方面涉及一种用于测序应用的试剂盒，其包括：
[0017]用第一可检测标记标记的第一类型的核苷酸；
[0018]用第二可检测标记标记的第二类型的核苷酸；
[0019]用第一可检测标记标记的第三类型的核苷酸；以及
[0020]用第二可检测标记标记的第三类型的核苷酸；
[0021]其中第一可检测标记和第二可检测标记彼此为光谱上可区分的，第一可检测标记可由第一光源激发并且可由第一发射滤光器检测，并且第二可检测标记可由第二光源激发并且可由第二发射滤光器检测；
[0022]其中第一激发光源和第二激发光源中的一者具有约350nm至约410nm的波长，并且第一激发光源和第二激发光源中的另一者具有约450nm至约460nm的波长；并且
[0023]其中第一发射滤光器和第二发射滤光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于确定靶多核苷酸的序列的方法，所述方法包括：(a)使引物多核苷酸与包含第一类型的核苷酸、第二类型的核苷酸、第三类型的核苷酸和第四类型的核苷酸中的一种或多种的混合物接触，其中所述引物多核苷酸与所述靶多核苷酸的至少一部分互补；(b)将来自所述混合物的一种类型的核苷酸掺入到所述引物多核苷酸中以产生延伸的引物多核苷酸；(c)使用第一激发光源执行第一成像事件并且使用第一发射滤光器收集来自所述延伸的引物多核苷酸的第一发射信号；以及(d)使用第二激发光源执行第二成像事件并且使用第二发射滤光器收集来自所述延伸的引物多核苷酸的第二发射信号；其中所述第一激发光源和所述第二激发光源中的一者具有约350nm至约410nm的波长，并且所述第一激发光源和所述第二激发光源中的另一者具有约450nm至约460nm的波长；并且其中所述第一发射滤光器和所述第二发射滤光器中的一者具有约415nm至约450nm的检测波长，并且所述第一发射滤光器和所述第二发射滤光器中的另一者具有约480nm至约525nm的检测波长。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一类型的核苷酸用第一可检测标记标记，所述第一可检测标记可由所述第一激发光源激发并且可由所述第一发射滤光器检测。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二类型的核苷酸用第二可检测标记标记，所述第二可检测标记可由所述第二激发光源激发并且可由所述第二发射滤光器检测，并且其中所述第二类型的可检测标记与所述第一类型的可检测标记为光谱上可区分的。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第三类型的核苷酸用第一可检测标记和第二可检测标记两者标记，并且所述第三类型的核苷酸可由所述第一激发光源和所述第二激发光源两者激发。5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第三类型的核苷酸包括用第三标记标记的第三类型的核苷酸和用第四标记标记的第三类型的核苷酸的混合物，其中所述第三标记可由所述第一激发光源激发并且可由所述第一发射滤光器检测，并且其中所述第四标记可由所述第二激发光源激发并且可由所述第二发射滤光器检测。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一类型的核苷酸、所述第二类型的核苷酸和所述第三类型的核苷酸中的每一者是未标记的，并且所述方法还包括：在所述第一成像事件之前使所述延伸的引物多核苷酸与亲和试剂集合接触，其中所述集合中的至少一种亲和试剂特异性结合到所述掺入的第一类型的核苷酸、第二类型的核苷酸或第三类型的核苷酸。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述亲和试剂集合包含：特异性结合到所述第一类型的核苷酸的第一亲和试剂、特异性结合到所述第二类型的核苷酸的第二亲和试剂。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一亲和试剂包含一个或多个第一可检测标记，所述第一可检测标记可由所述第一激发光源激发并且可由所述第一发射滤光器检测，所述第二亲和试剂包含一个或多个第二可检测标记，所述第二可检测标记可由所述第二激发光源激发并且可由所述第二发射滤光器检测，并且其中所述第一可检测标记与所述第二
可检测标记为光谱上可区分的。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述第一亲和试剂和所述第二亲和试剂两者特异性结合到所述第三类型的核苷酸。10.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述亲和试剂集合还包含特异性结合到所述第三类型的核苷酸的第三亲和试剂，并且其中所述第三亲和试剂包含一个或多个第三可检测标记和一个或多个第四可检测标记，所述第三可检测标记可由所述第一激发光源激发并且可由所述第一发射滤光器检测，所述第四可检测标记可由所述第二激发光源激发并且可由所述第二发射滤光器检测。11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述第一类型的核苷酸包含第一半抗原，并且所述第一亲和试剂包含特异性结合到所述第一半抗原的第一半抗原结合配偶体。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一半抗原包含生物素部分，并且所述第一半抗原结合配偶体包含链霉亲和素。13.根据权利要求7至12中任一项所述的方法，其中所述第二类型的核苷酸包含第二半抗原，并且所述第二亲和试剂包含特异性结合到所述第二半抗原的第二半抗原结合配偶体。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二半抗原包含氯烷基基团，并且所述第二半抗原结合配偶体包含15.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一类型的核苷酸用第一可检测标记标记，所述第二类型的核苷酸是未标记的，所述第三类型的核苷酸是未标记的和用所述第一可检测标记标记的，并且所述第一可检测标记可由所述第一激发光源激发并且可由所述第一发射滤光器检测，并且所述方法还包括：在所述第一成像事件之前使所述延伸的引物多核苷酸与亲和试剂接触，其中所述亲和试剂特异性结合到所述第二类型的未标记核苷酸或所述第三类型的未标记核苷酸。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述亲和试剂包含一个或多个第二可检测标记，所述第二可检测标记可由所述第二激发光源激发并且可由所述第二发射滤光器检测。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述亲和试剂包含链霉亲和素，并且所述第二类型的核苷酸和所述第三类型的未标记核苷酸均包含生物素部分。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一类型的核苷酸是未标记的，所述第二类型的核苷酸用第二可检测标记标记，所述第三类型的核苷酸是未标记的和用所述第二可检测标记标记的，并且所述第二可检测标记可由所述第二激发光源激发并且可由所述第二发射滤光器检测，并且所述方法还包括：在所述第一成像事件之前使所述延伸的引物多核苷酸与亲和试剂接触，其中所述亲和试剂特异性结合到所述第一类型的未标记核苷酸或所述第三类型的未标记核苷酸。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述亲和试剂包含一个或多个第一可检测标记，所述第一可检测标记可由所述第一激发光源激发并且可由所述第一发射滤光器检测。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述亲和试剂包含链霉亲和素，并且所述第一类型的核苷酸和所述第三类型的未标记核苷酸均包含生物素部分。21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述第四类型的核苷酸是未标记的
(暗色)，或用不具有来自所述第一成像事件或所述第二成像事件的发射的荧光部分标记。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述四种类型的核苷酸包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP或它们的非天然核苷酸类似物。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述混合物中所述四种类型的核苷酸中的每一种均具有3'羟基封端基团。24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，所述方法还包括：(e)在所述第二成像事件之后并且在下一次测序循环之前从所述掺入的核苷酸去除所述3'羟基封端基团。25.根据权利要求24所述的方法，所述方法还包括：重复步骤(a)
‑
(e)多个循环；以及基于所述依序掺入的核苷酸来确定所述靶多核苷酸的序列。26.根据权利要求25所述的方法，其中步骤(a)
‑
(e)重复至少50个循环。27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述第一激发光源和所述第二激发光源中的每一者包括激光、发光二极管(LED)或它们的组合。28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述第一激发光源具有约350nm至约410nm的波长，并且所述第一发射滤光器具有约415nm至约450nm的检测波长。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二激发光源具有约450nm至约460nm的波长，并且所述第二发射滤光器具有约480nm至约525nm的检测波长。30.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述第一激发光源具有约450nm至约460nm的波长，并且所述第一发射滤光器具有约480nm至约525nm的检测波长。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二激发光源具有约350nm到约410nm的波长，并且所述第二发射滤光器具有约415nm至约450nm的检测波长。32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述延伸的引物多核苷酸在所述第一成像事件和所述第二成像事件期间是在包含一种或多种抗氧化剂的缓冲溶液中。33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸固定到固体载体。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述固体载体包含多个固定的靶多核苷酸。35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述固体载体包括流通池。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述流通池是包括多个纳米孔的图案化流通池，并且每个纳米孔包括一个固定的靶多核苷酸。37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述固定的靶多核苷酸在所述固体载体上的密度为约100k/mm2至约300k/mm2。38.一种用于测序应用的试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓琳，C，
申请(专利权)人：伊鲁米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：