具有提高的对基因变异的辨别性的DNA聚合酶变体制造技术

本发明专利技术涉及一种属于A家族的DNA聚合酶变体及其用途，并且本发明专利技术涉及一种DNA聚合酶变体，当引物3'末端的碱基与模板互补时，顺利聚合，当引物3'末端的碱基与模板不互补时，聚合被抑制，从而容易辨别这两种情况，而且本发明专利技术涉及一种利用所述变体的PCR方法及包含所述变体的PCR试剂盒。本发明专利技术对单核苷酸多态性分析(SNP基因分型)及体细胞突变检测等有用。(SNP基因分型)及体细胞突变检测等有用。(SNP基因分型)及体细胞突变检测等有用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有提高的对基因变异的辨别性的DNA聚合酶变体


[0001]本专利技术涉及一种属于A家族的DNA聚合酶变体及其用途，并且本专利技术涉及一种DNA聚合酶变体，当引物3'末端的碱基与模板互补时，顺利聚合，当引物3'末端的碱基与模板不互补时，聚合被抑制，从而容易辨别(discrimination)这两种情况，而且本专利技术涉及一种利用所述变体的PCR方法及包含所述变体的PCR试剂盒。本专利技术对单核苷酸多态性分析(SNP基因分型(genotyping))及体细胞突变检测(somatic mutation detection)等有用。

技术介绍

[0002]识别参与人类等各种生物体的性状、药物代谢、免疫反应、遗传性疾病和癌症等疾病等的遗传变异，即单核苷酸多态性、添加、缺失等遗传变异对于实现精准医疗非常重要，如治疗的预测、治疗方法的确定、治疗的预后及复发的观察等(Auton,Brooks et al.2015,Zhang,Qin et al.2004,Poste 2001,Nakagawa and Fujita 2018,Martincorena and Campbell 2015)。此外，遗传变异的识别或辨别对于农业食品领域的育种及选种、原产地及品种的鉴定等也非常有用。
[0003]遗传变异可能固有地存在于生物体中或者在生长过程中因环境或内源性原因而发生。在人体等遗传变异形态中最常见的是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。在以下专利技术的说明中，作为各种遗传变异的代表，以SNPs为例进行说明。
[0004]在用于鉴定包括人类在内的生物体所具有的SNPs的方法中，最普遍、经济和简便的方法是利用聚合酶的基因扩增技术，即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，特别是在PCR过程中可以实时测量基因变异量的定量实时PCR(quantitative real time PCR，“qPCR”或“实时PCR”)是有用的。实时PCR是一种核酸的定性和定量检测技术，已应用在卫生、农业、食品、环境等各种领域中。20世纪90年代初开发的实时PCR正在不断克服技术上的局限性，发展成为更准确、精密的技术。
[0005]在使用实时PCR的基因鉴定试剂盒的开发中，非特异性信号的产生以及对突变和野生型基因序列的低辨别性被认为是实时PCR的代表性技术局限性。
[0006]特别地，为了开发实时PCR技术作为癌症、病原体检测等诊断技术，必须对非特异性信号进行控制。由于非特异性信号而出现假阳性时，检测的可靠性降低，特别是在需要检测极少量的无创性或微创性液体活检(liquid biopsy)等诊断技术中，为了准确诊断少量的目标变异，需要提高PCR效率并提高特异性(specificity)的技术。为了提高PCR的效率和特异性，一直在寻找开发添加到PCR溶液中的组合物、设计特殊的探针(probes)或引物(primers)或者改良酶的方法。
[0007]对于添加到PCR溶液中的组合物，主要研究了提高PCR的反应性的方法、用于消除引物二聚体(primer dimers)的形成、使用的引物与非特异性靶标结合形成的非特异性PCR产物的形成或者通过高GC比例及特异性高次结构的形成等使PCR效率降低的添加组合物。这些组合物包括二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、甜菜碱(betaine)等。
[0008]并且，已报道有如下方法：为了所谓的热启动(HotStart)PCR，通过阻断在低温下进行的反应并在高温下进行PCR来防止非特异性扩增的方法。其中，已知的热启动PCR方法包括：添加DNA聚合酶(DNAP)特异性单克隆抗体的方法[Biotechniques(1994)16(6):1134
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1137]，添加抑制DNA聚合酶活性的单链寡核苷酸即适配体(aptamer)的方法[US/005693502A(1997)(Gold and Jayasena 1997)；J.Mol.Biol.271:100
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111(1997)(Lin and Jayasena 1997)；Nucleic Acids Research Supplement No.3:309
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310(2003)(Ikebukuro and Noma2003)]，或使用双链核苷酸抑制非特异性DNA合成的方法，其中，所述双链核苷酸具有在低温下与DNA聚合酶结合的能力，并且抑制DNA聚合酶的活性，但在特定温度以上的PCR条件下不形成双螺旋，因此不抑制DNA聚合酶活性[J.Mol Biol.264(2):268
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278(1996)(Dang and Jayasena 1996)；US 8,043,816 B2(2011)(Astatke,Chatterjee et al.2011)]。
[0009]在使用特殊的探针和/或引物提高PCR的效率和特异性的方法中，特殊的探针和引物用于特异性地检测扩增的目标产物，已经开发了使用具有高特异性的探针的方法。在实时PCR中使用SYBR green I或SYTO9等DNA结合荧光团时会检测到整体扩增产物，因此存在经常产生非特异性信号的问题。为了解决这个问题，开发了目标序列特异性探针(target sequence specific probes)，这种探针包括：TaqMan探针(双标记信号水解探针(dual labelled signaling hydrolysis probe))[P Natl Acad Sci USA88,7276
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280(1991)(Holland,Abramson et al.1991)]，分子信标(molecular beacons)[Methods.25,463
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71(2001)(Mhlanga and Malmberg 2001)]，蝎子探针(scorpion probes)[Nat Biotechnol.17,804
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07(1999)(Baner,Nilsson et al.1998)]，LUX(light upon extension)引物[Nucleic acids research.30,e37(2002)(Nazarenko,Lowe et al.2002)]，Amplifluor引物[BioTechniques.26,552
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58(1999)(Uehara,Nardone et al.1999)]等。
[0010]此外，为了选择性地扩增目标变异基因，开发了使用具有高特异性的引物或特殊的寡核苷酸阻断剂(oligonucleotides blocker)的方法等。使用具有高特异性的引物的方法包括突变阻滞扩增系统PCR(amplification refractory mutation system PCR，ARMS
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PCR)等方法，所述ARMS
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种DNA聚合酶变体，在与由SEQ ID NO：1组成的Taq DNA聚合酶具有80％以上的同源性的DNA聚合酶或它们的Klenow片段中Ha序列和Hb序列之间的环区的一种以上的氨基酸发生变异，并且与野生型DNA聚合酶相比，保持聚合活性，并具有提高的对等位基因或基因变异的辨别性。2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述环区是SEQ ID NO：1的497
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514位置或其相应的位置。3.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述变异是氨基酸的取代、插入或缺失。4.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述具有80％以上的同源性的DNA聚合酶与由SEQ ID NO：1组成的Taq DNA聚合酶具有90％以上的同源性。5.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述具有80％以上的同源性的DNA聚合酶与由SEQ ID NO：1组成的Taq DNA聚合酶具有95％以上的同源性。6.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述变异发生在选自SEQ ID NO：1的497、498、499、500、501、502、503、505、506、509、510、511、512、513、514或在其相应的位置中的一个以上的位置处。7.根据权利要求6所述的DNA聚合酶变体，其中，存在于497、505、511、512位置处或在其相应的位置处的带...

【专利技术属性】
技术研发人员：金载钟，林時圭，柳正铉，李甫媄，金瑟琪，车善浩，
申请(专利权)人：基诺泰科有限公司，
类型：发明
国别省市：