利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法，该模型拥有致密而复杂的肺脏结构，可耐受体内通用诱导剂博来霉素的长期诱导，极大延长了纤维化模拟与药效分析的时间窗。除含有肺的主要上皮细胞类型外，模型中的巨噬细胞具备功能性，可忠实地还原肺驻留巨噬细胞通过分泌TGF

【技术实现步骤摘要】
利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法


[0001]本专利技术涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法。

技术介绍

[0002]特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是最常见的特发性间质肺病，死亡率高于多数肿瘤，患者中位生存期仅2
‑
3年。近20年来，＞70种抗纤维化药物虽在临床前模型上呈现显著药效，但均在临床试验遭遇失败。传统模型药物评价效力的不足，要求亟待建立更准确、可靠的新模型。随着再生医学的迅速发展，人源类器官技术从悄然诞生到备受瞩目。相比传统细胞模型，这些类器官在细胞种类、结构特征与功能特性上均表现出更好的生理相关性；而人源化的特点又能很好的克服动物模型由于物种差异所造成的结果偏差。
[0003]目前，肺类器官可由人多能干细胞（hPSC）或人成体干细胞（hASC）诱导分化产生。而无论是hPSC或hASC来源，其均主要由上皮细胞构成（如肺泡细胞、杯状细胞、纤毛细胞等），缺乏病理相关的重要细胞类型，如巨噬细胞。大量研究表明，在IPF中，驻留于肺的巨噬细胞主导了促炎因子分泌、抗炎因子分泌、前纤维化因子产生等一系列重要的病理分子事件；特别是由其产生的内源性TGF
‑
β1（纤维化中枢信号），其直接导致了纤维化终末信号的激活，引发胶原沉积与纤维化瘢痕累积。因此，现有肺类器官模型缺乏巨噬细胞的现状限制了模拟纤维化的能力。
[0004]另一方面，除谱系缺失的问题，现有模型的结构缺陷则限制了纤维化模拟的准确性。目前，博来霉素是动物模型进行肺纤维化造模的通用型诱导剂，其诱发的纤维化特征类似于人体，故被广泛接纳与采用。然而，由于当下体外模型的结构十分简单（如单层细胞、囊泡样类器官等），往往难以耐受博来霉素的细胞毒性，尚未诱导出现纤维化表型便已大量死亡。因此，鲜有在体外模型中使用博来霉素的报道。“取而代之”的，只能利用纤维化的下游信号分子去直接触发纤维化表型（如TGFβ1、IL
‑
11等），如此便忽视了许多中间过程发生的重要分子事件，如肺上皮细胞的受损老化、巨噬细胞极化与抗炎/促炎调控等，严重违背了体内纤维化发生发展的真实情况；这在一定程度揭示了基于此类模型的药效数据与临床结果大相径庭的原因。不仅如此，纤维化的形成本是日积月累的长效过程，而当下体外模型使用下游信号分子直接触发纤维化的时间普遍≤48h（动物中的博来霉素造模约20天左右），纤维化进展的全貌与相应药效也由此变得难以捕获。
[0005]综上，1）缺乏功能性巨噬细胞和2）结构过分单一的问题严重限制了当下肺类器官模型模拟纤维化的能力。倘若存在一个具备功能性巨噬细胞的肺类器官，同时拥有更好的结构性以耐受体内通用诱导剂博来霉素的长期造模过程，则有望从头地、精准地在体外模拟纤维化病理的发生发展，为抗纤维化药物测试提供一个可靠的人源评价工具。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术旨在提供一种基于全肺类器官的博来霉素诱导肺纤维化的方法 ，该肺类器官不仅在兼具了功能性巨噬细胞与上皮细胞，且具备致密而复杂的肺脏结构特征，能够耐受博来霉素的长时间诱导。凭借此全新的纤维化疾病模型，我们不但于体外呈现了纤维化标志物基因/蛋白的上调，还忠实还原了肺驻留的巨噬细胞通过分泌TGF
‑
β1而促进胶原沉积的机制，因此适合作为新一代IPF体外疾病模型，用于纤维化进展的全程模拟与抗纤维化药物的精准筛选。
[0007]为达到上述目的，本专利技术的技术方案实现方式如下：一种利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法，该方法包括如下步骤：1）全肺类器官的构建先使用含有GDF的培养基诱导hPSC分化为定形内胚层；然后在培养基中持续添加ATRA，并添加肺上皮细胞相关诱导分化因子、巨噬细胞诱导分化因子和EGM2将其诱导分化为肺芽；最后将肺芽用含有I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的ECM进行包被，并添加肺上皮促成熟因子继续培养，历时60
‑
65天得到兼具肺驻留巨噬细胞的全肺类器官；2）肺纤维化疾病模型的构建I）分别使用M1、M2极化诱导剂孵育全肺类器官，验证巨噬细胞具备向M1/M2型巨噬细胞极化的能力；II）使用浓度为10
‑
100μg/ml的博来霉素处理步骤1）得到的全肺类器官，诱导肺驻留巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，极化得到的M2型巨噬细胞分泌TGF
‑
β1，使得培养上清中TGF
‑
β1含量增加并作用于全肺类器官构建肺纤维化疾病模型。
[0008]进一步，使用博来霉素处理8
‑
30天。
[0009]进一步，GDF为GDF3、GDF5、GDF7、GDF8中的任一种，优选GDF8，GDF的使用量为20
‑
500ng/ml。
[0010]进一步，ATRA的使用量为0.01
‑
10μM，巨噬细胞诱导分化因子包括EGF、VEGF、bFGF，其中，EGF的使用量为1
‑
50ng/ml，VEGF的使用量为0.5
‑
100ng/ml，bFGF的使用量为0.5
‑
50ng/ml；各阶段添加的EGM2的体积百分比为5%
‑
60%。
[0011]进一步，肺上皮细胞相关诱导分化因子包括GSK
‑
3抑制剂、BMP4、FGF10、KGF、ATRA；其中，GSK
‑
3抑制剂的使用量为0.1
‑
10μM，BMP4的使用量为1
‑
50ng/ml，FGF10的使用量为1
‑
50ng/ml，KGF的使用量为1
‑
50ng/ml，ATRA的使用量为0.01
‑
10μM。
[0012]进一步，肺上皮促成熟因子包括地塞米松、PDE抑制剂、PKA激活剂。
[0013]相对于现有技术，本专利技术所述的利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法 具有以下优势：本专利技术所述的利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法，该肺类器官不仅包含多种上皮细胞类型，还兼具驻留肺的功能性巨噬细胞；在此基础上进行肺类器官纤维化模型的构建，该肺纤维化模型可模拟肺驻留巨噬细胞在纤维化进程中的动态变化与功能（如M1/M2型极化、促炎/抗炎因子分泌等），同时该模型在多个方面重现了纤维化进展中的不同病理表征，忠实地呈现了IPF的病理，证明了驻留肺的巨噬细胞在IPF进展中的关键作用。另外，该模型更适用于研究通过抑制M2巨噬细胞分化来降低TGF
‑
β1信号的抗纤维化药效评价，缩短药物开发周期，提高成功率。
附图说明
[0014]构成本专利技术的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1为S3阶段Day60的结果图；其中，A图为Day60全肺类器官形本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1）全肺类器官的构建先使用含有GDF的培养基诱导hPSC分化为定形内胚层；然后在培养基中持续添加ATRA，并添加肺上皮细胞相关诱导分化因子、巨噬细胞诱导分化因子和EGM2将其诱导分化为肺芽；最后将肺芽用含有I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的ECM进行包被，并添加肺上皮促成熟因子继续培养，历时60
‑
65天得到兼具肺驻留巨噬细胞的全肺类器官；2）肺纤维化疾病模型的构建I）分别使用M1、M2极化诱导剂孵育全肺类器官，验证巨噬细胞具备向M1/M2型巨噬细胞极化的能力；II）使用浓度为10
‑
100μg/ml的博来霉素处理步骤1）得到的全肺类器官，诱导肺驻留巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，极化得到的M2型巨噬细胞分泌TGF
‑
β1，使得培养上清中TGF
‑
β1含量增加并作用于全肺类器官构建肺纤维化疾病模型。2.根据权利要求1所述的利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法，其特征在于：使用博来霉素处理8
‑
30天，期间每48h更换培养基。3.根据权利要求1所述的利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法，其特征在于：GDF为GDF8，使用量为20
‑
500ng/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴迪，葛啸虎，
申请(专利权)人：淇嘉科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：