磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原、广谱检测抗体及其ELISA检测方法技术

本发明专利技术提供了磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原、广谱检测抗体及其ELISA检测方法，属于免疫分析技术领域。本发明专利技术构建磺胺类(sulfonamides,SAs)和四环素类(tetracyclines,TCs)抗生素的人工复合抗原，在人工抗原内引入磺胺片段和四环素片段，通过戊二醛连接臂将磺胺片段、四环素片段与载体蛋白连接，得到磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原。此人工复合抗原经动物免疫后可以得到对SAs和TCs具有特异性、效价高的广谱抗体，可以直接检测样品中SAs和TCs总量。本发明专利技术提供了一种磺胺类和四环素类抗生素总量的ELISA检测方法，此法对SAs和TCs类抗生素线性良好。此法对SAs和TCs类抗生素线性良好。此法对SAs和TCs类抗生素线性良好。

【技术实现步骤摘要】
磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原、广谱检测抗体及其ELISA检测方法


[0001]本专利技术涉及免疫分析
，特别涉及磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原、广谱检测抗体及其ELISA检测方法。

技术介绍

[0002]抗生素从生产到消费中的各个环节都有可能进入环境，环境中残留的抗生素会导致耐药基因的产生，改变微生物生态环境；同时由于食物链积累，抗生素也会对人体造成不可预计的危害。目前，抗生素对水体的污染日益严重，医疗卫生、畜牧养殖、水产养殖成为环境水体中抗生素的主要污染源。虽然各地污染程度大不相同，但是检出频率较高，在我国检出浓度较大的抗生素种类依次为：磺胺类、四环素类、大环内酯类、喹诺酮类、氯霉素类。因此，构建快速高效的抗生素类物质的检测方法显得尤为重要。
[0003]目前国内外对水体中抗生素的检测方法主要是仪器分析法，此类方法对仪器条件要求高，前处理操作相对复杂、耗时。ELISA利用抗原
‑
抗体特异性反应，很好的弥补了仪器分析法的不足，由于不需要昂贵的仪器设备，且特异性强、灵敏度高、操作简便快捷，在现场筛选和大量样本的快速检测中显示了其独特的优势。
[0004]目前对于水体中抗生素的ELISA检测方法已有研究，这些方法均采用一种载体蛋白偶联一种半抗原制备人工抗原，通过免疫动物制备特异性多克隆/单克隆抗体，进而开发出相应的ELISA检测方法。但抗生素种类繁多，通过一种ELISA检测方法只能测定一种抗生素的含量，如果需要了解样品中某类抗生素或者某几类抗生素的总量，就需要进行很多次的测定再将结果汇总，势必会增加工作量，延长检测时间。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术目的在于提供磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原、广谱检测抗体及其ELISA检测方法。本专利技术提供的人工复合抗原能够制备出可以同时检测多种抗生素类物质的广谱抗体，实现磺胺类和四环素类抗生素的同时检测。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种人工复合抗原，具有式I所示结构：
[0008][0009]式I中，“N
‑
Protein
‑
N”表示载体蛋白。
[0010]优选的，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。
[0011]本专利技术提供了上述人工复合抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0012]将磺胺、戊二醛、载体蛋白、醇溶剂和缓冲溶液混合，进行第一偶联反应，得到具有式a所示结构的化合物；
[0013][0014]将所述具有式a所示结构的化合物、四环素和戊二醛混合，进行第二偶联反应，得到具有式I所示结构的人工复合抗原。
[0015]优选的，所述第一偶联反应的温度为22～26℃，时间为4～5h；
[0016]所述第二偶联反应的温度为22～26℃，时间为4～5h。
[0017]本专利技术提供了上述人工复合抗原在制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体中的应用。
[0018]本专利技术提供了一种磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体，由上述人工复合抗原免疫宿主动物得到。
[0019]本专利技术提供了上述检测磺胺类和/或四环素类抗生素的试剂盒，包括包被抗原，封闭剂，磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体，酶标二抗，显色剂，酶标板；
[0020]所述包被抗原为上述人工复合抗原；
[0021]所述包被抗原结构中的载体蛋白与制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白不同。
[0022]优选的，所述包被抗原结构中的载体蛋白为卵清蛋白，制备磺胺类和四环素类抗
生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白为牛血清蛋白；
[0023]或者，所述包被抗原结构中的载体蛋白为牛血清蛋白，制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体所用人工复合抗原结构中的载体蛋白为卵清蛋白。
[0024]本专利技术提供了一种磺胺类和四环素类抗生素总量的ELISA检测方法，包括以下步骤：
[0025]将含有包被抗原的缓冲溶液加至酶标板中，进行第一孵育，得到包被有包被抗原的酶标板；
[0026]将封闭剂加至所述包被有包被抗原的酶标板中，进行第二孵育，洗去未结合物，得到封闭酶标板；
[0027]将待测液和磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体加至所述封闭酶标板中，进行第三孵育，洗去未结合物，得到竞争结合后的酶标板；
[0028]将酶标二抗加至所述竞争结合后的酶标板中，进行第四孵育，洗去未结合物，之后加入显色剂进行显色反应，测定所得显色反应液在492nm处的吸光度值；
[0029]根据所述吸光度值计算抑制率；
[0030]根据所述抑制率和标准曲线获得待测液中磺胺类抗生素和四环素类抗生素的总浓度；所述标准曲线为磺胺类抗生素和四环素类抗生素总浓度的自然对数值与抑制率的线性关系曲线。
[0031]优选的，所述磺胺类抗生素为磺胺、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺噻唑中的一种或几种；
[0032]所述四环素类抗生素为四环素、金霉素、土霉素和环霉素中的一种或几种。
[0033]本专利技术提供了一种人工复合抗原，具有式I所示结构。本专利技术构建磺胺类(sulfonamides,SAs)和四环素类(tetracyclines,TCs)抗生素的人工复合抗原，在人工抗原内引入磺胺片段和四环素片段，通过戊二醛连接臂将磺胺片段、四环素片段与载体蛋白连接，得到磺胺类和四环素类抗生素的人工复合抗原。此人工复合抗原经动物免疫后可以得到对SAs和TCs具有特异性、效价高的广谱抗体，可以直接检测样品中SAs和TCs总量。
[0034]本专利技术提供了一种磺胺类和四环素类抗生素总量的ELISA检测方法，此法对SAs和TCs类抗生素线性良好。实施例结果表明，本专利技术提供的ELISA 检测方法对于磺胺SA、磺胺吡啶SP、磺胺嘧啶SD、磺胺噻唑ST、四环素 TC、金霉素CTC、土霉素OTC、环霉素DC的IC
50
分别为：16.3、21.8、18.3、 20.5、17.3、22.3、17.9、20.2ng/mL，检测下限IC
10
分别为：0.46、0.54、0.48、 0.53、0.49、0.51、0.50、0.49ng/mL，具有高灵敏度和低检测限；对单加标水样中的SAs和TCs抗生素的回收率范围为：97.12～98.87％，可有效检测水中以上各类抗生素。对混合标水样中的SAs和TCs抗生素总量检测的回收率范围为：96.25～98.56％，可有效检测水中SAs和TCs抗生素总量。
附图说明
[0035]图1为本专利技术人工复合抗原的合成路线；
[0036]图2为本专利技术所得人工复合抗原的紫外光谱扫描结果。
具体实施方式
[0037]本专利技术提供一种人工复合抗原，具有式I所示结构：
[0038][0039]在本专利技术中，“N
‑
Protein
‑
N”本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工复合抗原，具有式I所示结构：式I中，“N
‑
Protein
‑
N”表示载体蛋白。2.根据权利要求1所述的人工复合抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。3.权利要求1或2所述的人工复合抗原的制备方法，包括以下步骤：将磺胺、戊二醛、载体蛋白、醇溶剂和缓冲溶液混合，进行第一偶联反应，得到具有式a所示结构的化合物；将所述具有式a所示结构的化合物、四环素和戊二醛混合，进行第二偶联反应，得到具有式I所示结构的人工复合抗原。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一偶联反应的温度为22～26℃，时间为4～5h；所述第二偶联反应的温度为22～26℃，时间为4～5h。5.权利要求1或2所述的人工复合抗原或权利要求3或4所述制备方法制备得到的人工复合抗原在制备磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体中的应用。6.一种磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体，由权利要求1或2所述的人工复合抗原或权利要求3或4所述制备方法制备得到的人工复合抗原免疫宿主动物得到。7.一种检测磺胺类和/或四环素类抗生素的试剂盒，包括包被抗原，封闭剂，权利要求6所述的磺胺类和四环素类抗生素广谱检测抗体，酶标二抗，显色剂，酶标板；所述包被抗原为权利要求1或2所述的人工复合抗原或权利要求3或4所述制备方法制
备得到的人工复合抗原；所述包被抗原结构中的载体蛋白与制备磺胺类和四环素类抗生素...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘旭东，张玉超，吴福勇，余梅，
申请(专利权)人：茅台学院，
类型：发明
国别省市：