一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用，从细菌菌株FY1中克隆得到野生型果胶酸裂解酶基因BaPel，并测序获得完整野生型果胶酸裂解酶基因序列；通过Discovery Studio软件将野生型果胶酸裂解酶基因序列的155位的甘氨酸Gly突变成丙氨酸Ala或缬氨酸Val，并克隆出果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。与现有技术相比，本发明专利技术克隆的果胶酸裂解酶基因突变体G155A可以增加酶在30

【技术实现步骤摘要】
一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用。

技术介绍

[0002]果胶酸裂解酶(Pectate lyase)属于果胶酶的一种，可有效降解果胶类物质。果胶酸裂解酶可用于多种工业加工，如食品业的果蔬汁澄清，纺织业的植物纤维脱胶和棉织物精炼等。近年来，随着酶工程的迅猛发展，因其高效、安全、经济等优点，在能源开发，环境保护，水质净化与石油污染净化方面的应用日益扩大。其中，果胶酸裂解酶就曾被利用进行污水处理且有效地降低了环境污染。
[0003]微生物产酶是果胶酸裂解酶的主要来源方式。根据文献报道来自微生物的果胶酸裂解酶的比活力一般为45
‑
600U/mg，野生型酶比活力相对较低且温度稳定性较差，不能有效的满足工业的要求。

技术实现思路

[0004]本专利技术是要解决现有技术中存在的不足，提供一种果胶酸裂解酶基因突变体及其克隆方法和应用，以达到改变果胶酸裂解酶基因结构达到提高酶活或热稳定性的目的。
[0005]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0006]本专利技术的第一个目的是要提供一种果胶酸裂解酶基因突变体克隆方法，包括以下步骤：
[0007]S1、从细菌菌株FY1中克隆得到野生型果胶酸裂解酶基因BaPel，并测序获得完整野生型果胶酸裂解酶基因序列；
[0008]S2、通过Discovery Studio软件将野生型果胶酸裂解酶基因序列的155位的甘氨酸Gly突变成丙氨酸Ala或缬氨酸Val，并克隆出果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。
[0009]进一步地，所述步骤S1中克隆野生型果胶酸裂解酶基因BaPel具体方法如下：
[0010]利用同源克隆的方法，将FY1菌株16Sr DNA序列与NCBI上nucleartide数据库进行比对，以同源性最高的Bacillus altitudinis果胶酸裂解酶基因为模板设计引物，F1:5
’‑
ATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTT
‑3’
，R1:5
’‑
TTAAGGATTTACTTTTCCTACACCCG
‑3’
；用FY1基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系：94℃
‑
4min，94℃
‑
30S，60℃
‑
30S，72℃
‑
2min，30个循环，72℃
‑
10min；即得野生型果胶酸裂解酶基因BaPel。
[0011]进一步地，所述步骤S2中克隆出果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V具体包括：
[0012]通过Discovery Studio软件对蛋白进行虚拟氨基酸突变，确定突变位点后；利用野生型果胶酸裂解酶基因序列为模板进行突变，并获得果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。用野生型果胶酸裂解酶BaPel基因为模板，使用设计的引
物：
[0013]引物名称引物序列(5
’
—3
’
)G155A
‑
F1CGGGATCCATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTTG155A
‑
R1GTTTTTAGAGCCGCCTTCGATTGCGATGGCATCTTTATCACCGAG155A
‑
F2ATCGAAGGCGGCTCTAAAAACG155A
‑
R2CCCAAGCTTTTAAGGATTTACTTTTCCTACACCCGG155V
‑
F1CGGGATCCATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTTG155V
‑
R1GTTTTTAGAGCCGCCTTCGATTACGATGGCATCTTTATCACCGAG155V
‑
F2ATCGAAGGCGGCTCTAAAAACG155V
‑
R2CCCAAGCTTTTAAGGATTTACTTTTCCTACACCCG
[0014]进行重叠PCR扩增，第一轮PCR扩增体系：94℃
‑
1min，98℃
‑
10S，60℃
‑
40S，72℃
‑
1min，30个循环；产物经试剂盒回收后作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR扩增体系：94℃
‑
4min，94℃
‑
30S，60℃
‑
30S，72℃
‑
2min，30个循环，72℃
‑
10min；即得果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。
[0015]本专利技术的第二个目的是要提供一种如权利要求1所述的克隆方法克隆得到的果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。
[0016]本专利技术的第三个目的是要提供一种果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V在微生物产果胶酸裂解酶中的应用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术本专利技术从一株溶藻菌基因组DNA中克隆获得果胶酸裂解酶基因，将该酶155位的甘氨酸(Gly)突变成丙氨酸(Ala)可以增加酶在30
‑
40℃的热稳定性，而将155位的甘氨酸(Gly)突变成缬氨酸(Val)可增加3倍的酶活，酶活可达756U/mg，这要明显高于目前报道的细菌果胶酸裂解酶酶活性。该方法简便快捷，可有效提高酶的活性及热稳定性，有利于生产实践的应用。
附图说明
[0018]图1为野生型和突变体酶活比较。
[0019]图2为野生型果胶酸裂解酶基因与其突变体的热稳定性对比图。
[0020]图3为野生型果胶酸裂解酶基因、果胶酸裂解酶基因突变体G155A、果胶酸裂解酶基因突变体G155V对铜绿微囊藻培养液降解后的颜色变化图：a、铜绿微囊藻培养液；b、野生型果胶酸裂解酶基因的降解结果；c、果胶酸裂解酶基因突变体G155A的降解结果；d、果胶酸裂解酶基因突变体G155V的降解结果。
[0021]图4为野生型果胶酸裂解酶基因、果胶酸裂解酶基因突变体G155A、果胶酸裂解酶基因突变体G155V对铜绿微囊藻的降解曲线。
具体实施方式
[0022]为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限定专利技术。
[0023]实施例1
[0024]从细菌菌株FY1中克隆得到野生型果胶酸裂解酶基因BaPel，并测序获得完整野生
型果胶酸裂解酶基因序列；
[0025]细菌菌株FY1是从扶余地区稻田水样中分离得到的，具体地：从稻田取得水样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种果胶酸裂解酶基因突变体克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、从细菌菌株FY1中克隆得到野生型果胶酸裂解酶基因BaPel，并测序获得完整野生型果胶酸裂解酶基因序列；S2、通过Discovery Studio软件将野生型果胶酸裂解酶基因序列的155位的甘氨酸Gly突变成丙氨酸Ala或缬氨酸Val，并克隆出果胶酸裂解酶基因突变体G155A或果胶酸裂解酶基因突变体G155V。2.根据权利要求1所述的果胶酸裂解酶基因突变体克隆方法，其特征在于，所述步骤S1中克隆野生型果胶酸裂解酶基因BaPel具体方法如下：利用同源克隆的方法，将FY1菌株16Sr DNA序列与NCBI上nucleartide数据库进行比对，以同源性最高的Bacillus altitudinis果胶酸裂解酶基因为模板设计引物，F1:5
’‑
ATGTTGAAGAAAAAAGTTCCAATGTT
‑3’
，R1:5
’‑
TTAAGGATTTACTTTTCCTACACCCG
‑3’
；用FY1基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系：94℃
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4min，94℃
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30S，60℃
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30S，72℃
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2min，30个循环，72℃
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10min；即得野生型果胶酸裂解酶基因BaPel。3.根据权利要求1所述的果胶酸裂解酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨美英，吴雷，杨雪，赵合美，朱原，武志海，魏晓双，田平，王东超，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：