一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法及其应用。本发明专利技术属于微生物领域，涉及植物促生根际细菌的趋化物，特别是指一种鉴定PGPR趋化不同趋化物到达根际速率的方法及其应用。本申请的方法可以实现区分PGPR趋化某种趋化物时的趋化速率和在根表的繁殖速率，通过比较PGPR某种趋化物的趋化受体缺失株与野生型和回补株趋化速率的差异，如果缺失株的趋化速率显著低于野生型和回补株，即可确定该趋化物是PGPR在根际趋化定殖的强趋化物。定该趋化物是PGPR在根际趋化定殖的强趋化物。定该趋化物是PGPR在根际趋化定殖的强趋化物。
【技术实现步骤摘要】
一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法及其应用
[0001]本专利技术属于微生物领域，涉及植物促生根际细菌的趋化物，特别是指一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法及其应用。
技术介绍
[0002][0003]植物通过根系分泌其固定的高达30％的碳，与根际细菌紧密互作。在植物根际生活着对植物生长有促进作用的细菌，称为植物促生根际细菌(plant growth promoting rhizobacteria， PGPR)。微生物肥料(菌肥)中应用的根瘤菌、固氮菌、解磷菌、解钾菌、促生菌和生防菌等，都是PGPR。大量研究表明，使用PGPR菌肥，能够减少化肥用量20％
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30％，减少农药用量30％以上，农作物增产10％
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80％，在发展可持续农业中的作用越来越受到重视，是实现化肥、农药双减目标的重要途径。
[0004]然而，PGPR在实际应用中的使用效果并不稳定，实验室和温室效果明显，大田效果较差，严重制约了PGPR菌剂的推广应用。PGPR能否发挥作用，取决于其能否在与土著微生物竞争中获得优势，从而在植物根际(根周围、根表、根组织)定殖。PGPR在根际定殖的第一步是识别根系分泌物作为趋化物，通过趋化运动到达根际，在根际繁殖并形成菌膜。PGPR 在根际的定殖量与促生效果呈显著正相关。植物根系分泌物包括有机酸、氨基酸、糖类等近百种，其中哪种成分是PGPR根际定殖的强趋化物质呢？许多研究发现，PGPR对苹果酸、草酸或谷氨酸、精氨酸等有强的趋化响应，可能是PGPR根际定殖的关键趋化物质。然而，这些分泌物成分也能吸引土著微生物趋化到达根际定殖，因此，可能并不是PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物。在鉴定出根系分泌物中PGPR强趋化物的基础上，应用基因工程技术提高PGPR在植物根际的趋化定殖竞争力，是解决PGPR促生效果不稳定的重要途径。
[0005]确定PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物常用的方法体外平板趋化和毛细管趋化实验，比较PGPR对趋化物的趋化响应；PGPR在根际定殖实验，比较添加某种根系分泌物对PGPR 在根际定殖量的影响，或构建PGPR某种(些)趋化物趋化受体的缺失突变株，考察这些趋化受体缺失突变株在根际的定殖量和定殖速率。体外平板趋化和毛细管趋化实验条件，与根际定殖条件有很大的不同，得到的结果仅可用作初步筛选。根际定殖实验则是测定PGPR在根际长时间定殖的结果，得到的定殖速率是PGPR趋化到达根际的速率和在根表繁殖的速率的总和，不能区分PGPR趋化到达根际的速率和在根表繁殖的速率。比较PGPR趋化不同趋化物到达根际的速率(简称为趋化速率)才是鉴定PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物的金标准；但是现有的方法并不能准确鉴定不同趋化物到达根际的速率，进而鉴定PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物。
技术实现思路
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提出一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化
速率的方法及其应用。
[0007]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0008]一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法，步骤为：
[0009](1)从微生物基因组的注释中查找该微生物的胞外配体结合域，筛选能够识别胞外趋化物的趋化受体，利用分子对接技术将趋化受体与根系分泌物成分进行分子对接，并计算结合自由能，筛选自由能值低的根系分泌物成分作为候选趋化物；
[0010](2)根据候选趋化物确定与候选趋化物对应的受体蛋白，以微生物的基因组DNA为模板，构建含有受体蛋白的胞外配体结合域片段的表达载体和敲除受体蛋白的重组载体；
[0011](3)将含有步骤(2)的重组载体的大肠杆菌通过接合方法转入微生物中获得趋化受体敲除突变株；
[0012](4)以微生物的基因组DNA为模板，构建步骤(2)中候选趋化物对应的受体蛋白的回补质粒和回补空载质粒，分别转入步骤(3)的趋化受体敲除突变株中，获得趋化受体敲除突变株的回补株和回补空载株；
[0013](5)将微生物、趋化受体敲除突变株、趋化受体敲除突变株的回补株和回补空载株与候选趋化物进行先进行平板趋化实验验证受体蛋白与趋化物的对应性，再利用微环境系统测定微生物、趋化受体敲除突变株和趋化受体敲除突变株的回补株在小麦根际的趋化速率和增殖速率。
[0014]进一步的，所述步骤(1)中根系分泌物成分包括氨基酸类、有机酸类和糖类；分子对接通过分子对接软件AutoDock 4.2实现；结合自由能是通过软件Amber17计算的。
[0015]进一步的，所述步骤(2)中根据候选强趋化物确定与候选强趋化物对应的受体蛋白是先利用毛细管趋化方法测定微生物趋化阈浓度值，确定该微生物对趋化物的响应强度，再采用荧光热漂移法和平板趋化法进一步鉴定该候选强强趋化物的受体蛋白。
[0016]进一步的，采用荧光热漂移法筛选趋化物与受体蛋白的荧光热漂移值高于2.0℃。
[0017]进一步的，所述步骤(3)中大肠杆菌为大肠杆菌S17
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1。
[0018]进一步的，所述步骤(5)中利用微环境系统的具体操作为：
[0019]a.向带盖试管中加入接种菌悬液的0.5
×
MS培养液，并将无菌小麦苗的根茎结合部用滤网固定在液面处；
[0020]b.将步骤a处理后的小麦苗样品置于16h光照8h黑暗培养，其中一半小麦苗接菌培养 2h后取出转移至未接种菌悬液的微环境系统中培养，作为转移组，另一半为未转移组；
[0021]c.步骤b中的两组麦苗分别在2h、6h、10h、14h、18h、22h、26h、30h、34h和 38h时取样，测定根际定殖的细菌数量；
[0022]d.采用Logistic方程拟合细菌在根际的生长动力学方程，并求其一阶导数得到生长速率值，通过计算获得不同接种菌的小麦根际趋化速率和增殖速率。
[0023]进一步的，所述步骤a中接种菌指微生物、趋化受体敲除突变株和趋化受体敲除突变株的回补株。
[0024]进一步的，所述步骤b中小麦苗样品置于16h光照8h黑暗培养时小麦苗的根部需要遮光处理。
[0025]进一步的，所述步骤d中小麦根际增殖速率为转移组生长速率，小麦根际趋化速率为未转移组生长速率与转移组生长速率的差值。
[0026]优选的，所述微生物为假单胞菌UW4。
[0027]上述方法在鉴定趋化物是PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物中的应用，具体方法为：如果趋化受体敲除突变株的趋化速率显著低于微生物和趋化受体敲除突变株的回补株，即可确定该趋化物是PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物。
[0028]本专利技术具有以下有益效果：
[0029]1、本申请的方法可以实现区分PGPR趋化某种趋化物时的趋化速率和在根表的繁殖速率，通过比较PGPR某种趋化物的趋化受体缺失株与野生型和回补株趋化速率的差异，如果缺失株的趋化速率显著低于野生型和回补株，即可确定该趋化物是PGP本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法，其特征在于，步骤为：（1）从微生物基因组的注释中查找该微生物的胞外配体结合域，筛选能够识别胞外趋化物的趋化受体，利用分子对接技术将趋化受体与根系分泌物成分进行分子对接，并计算结合自由能，筛选自由能值低的根系分泌物成分作为候选趋化物；（2）根据候选趋化物确定与候选趋化物对应的受体蛋白，以微生物的基因组DNA为模板，构建含有受体蛋白的胞外配体结合域片段的表达载体和敲除受体蛋白的重组载体；（3）将含有步骤（2）的重组载体的大肠杆菌通过接合方法转入微生物中获得趋化受体敲除突变株；（4）以微生物的基因组DNA为模板，构建步骤（2）中候选趋化物对应的受体蛋白的回补质粒和回补空载质粒，分别转入步骤（3）的趋化受体敲除突变株中，获得趋化受体敲除突变株的回补株和回补空载株；（5）将微生物、趋化受体敲除突变株、趋化受体敲除突变株的回补株和回补空载株与候选趋化物先进行平板趋化实验验证受体蛋白与趋化物的对应性，再利用微环境系统测定微生物、趋化受体敲除突变株和趋化受体敲除突变株的回补株在小麦根际的趋化速率和增殖速率。2.根据权利要求1所述的鉴定PGPR趋化不同趋化物到达根际速率的方法，其特征在于：所述步骤（1）中根系分泌物成分包括氨基酸类、有机酸类和糖类；分子对接通过分子对接软件AutoDock 4.2实现；结合自由能是通过软件Amber17 计算的。3.根据权利要求2所述的鉴定PGPR趋化不同趋化物到达根际速率的方法，其特征在于：所述步骤（2）中根据候选趋化物确定与候选趋化物对应的受体蛋白是先利用毛细管趋化方法测定微生物趋化阈浓度值，确定该微生物对趋化物的响应强度，再采用荧光热漂移法和平板趋化法进一步鉴定该候选强趋化物的受体蛋白。4.根据权利要求3所述的鉴定PGPR趋化不同趋化物到达根际速率的方法，其特征在于：采用荧光热漂移法筛选趋化物与受体蛋白的荧光热漂移值高于2.0℃。5.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱立友，柴冉，尚迪，李涛，宋安东，高玉千，李亚楠，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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