一种中华鳖精子形态均质化的处理方法技术

本发明专利技术公开了一种中华鳖精子形态均质化的处理方法，属于动物医学技术领域，本发明专利技术创造性地使用冰醋酸

【技术实现步骤摘要】
一种中华鳖精子形态均质化的处理方法


[0001]本专利技术涉及动物医学
，具体而言，涉及一种中华鳖精子形态均质化的处理方法。

技术介绍

[0002]中华鳖是一种传统的水产养殖越冬动物，这种动物的精子发生表现出典型的季节性差异。长江流域中华鳖的繁殖期从4月开始，睾丸功能正常，生精细胞持续发育；8月和9月达到繁殖高峰期。然而，精子发射发生在10月份之前，每年10月之后，未成熟的精子会被转移到附睾处储存至下一年的繁殖季节。因此，中华鳖附睾体内精子的保存可分为两个阶段：一是冬眠期间的长期保存，约为半年；二是生殖季节的短期保存。附睾上皮细胞也会根据精子在附睾中的储存方式经历季节性变化。通常认为，睾丸中的精子不能受精，其原因也在于：精子虽然产生于睾丸中，但睾丸中大部分精子是不成熟的，这导致睾丸中精子呈现出不均质的现象。更进一步表现为：睾丸排出的精子中，大量精子呈现出头部肥大的不成熟特征；而成熟的精子头部为细长状。
[0003]中华鳖精子头部的形成过程主要包括顶体形成、细胞核浓缩以及细胞核拉长变细，中华鳖的精子从产生到成熟一般需要2～3个月，其中在繁殖的季节附睾中容易排出不均质的精子，表现为含有大量的头部膨大的不成熟精子。精子的繁殖期不均质现象不利于中华鳖体外授精等细胞学操作的进行。因此，有必要开发一种促进中华鳖繁殖季节不均质精子形态成熟的技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的问题是促进繁殖期中华鳖不均质精子的形态均质化。
[0005]为解决上述问题，本专利技术第一方面提供一种中华鳖精子形态均质化的处理方法，包括以下步骤：
[0006]S1、孵育：取不均质精子与冰醋酸
‑
乙醇
‑
磷酸盐溶液混合，所述不均质精子为中华鳖睾丸排出的不均质精子，将混合液在15～25℃下孵育1～30小时；
[0007]S2、收集：取步骤S1中孵育完毕的混合液，离心机内以25℃、3000～5000rpm离心6～10分钟，收集沉淀后用杜氏磷酸盐溶液洗涤2～3次，所述洗涤方式为离心机内以25℃、3000～5000rpm离心6～10分钟，收集沉淀后依据实际情况重悬即可得到形态均质化的精子。
[0008]冰醋酸
‑
乙醇
‑
磷酸盐溶液与不均质中华鳖精子混合后，可在短时间内促使未成熟的不均质精子的形态不可逆转化为成熟均质精子形态。
[0009]进一步地，所述步骤S1中配制冰醋酸
‑
乙醇
‑
磷酸盐溶液时所述冰醋酸、乙醇、磷酸盐溶液的体积比为1：(2～4)：(5～8)，所述冰醋酸为有氧发酵法制备的食品级冰醋酸，乙醇为采用发酵生产的食品级酒精，纯度95％以上。
[0010]优选地，配制所述冰醋酸
‑
乙醇
‑
磷酸盐溶液时冰醋酸、乙醇、磷酸盐溶液的体积比
为1:3:6。
[0011]优选地，所述磷酸盐溶液包含140mM NaCl，5mM KCl，4mM NaHCO3，1mM MgSO4，0.5mM KH2PO4，0.5mM Na2HPO4，6mM D
‑
葡萄糖。
[0012]优选地，所述磷酸盐溶液的pH为7.0～7.4。
[0013]精子的最适生存环境为pH＝7.0～7.4，磷酸盐溶液具有较强的缓冲能力可维持稳定的pH环境，同时，促进精子形态均质化的冰醋酸和乙醇的浓度不宜过高，否则会导致精子死亡。
[0014]优选地，所述冰醋酸
‑
乙醇
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磷酸盐溶液与不均质精子的体积比为1:
[0015](50～100)。
[0016]优选地，为保证精子在孵育过程中的存活率，所述不均质精子的精子密度大于2
×
108个/mL。
[0017]精子产生于睾丸，但在睾丸中，大部分精子为不均质精子，其活力很低，无法用于授精等操作，从睾丸中采集精子操作简单且可以保证获得大量不均质精子，精子需转运至附睾中才可形成成熟的均质化精子，但精子在附睾中通常需要2～3个月才能成熟，周期较长，本专利技术优选睾丸中的不均质精子，可在最大限度上缩短精子形态均质化所需时间。
[0018]本专利技术具备的有益效果：本专利技术创造性地使用冰醋酸
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乙醇
‑
磷酸盐溶液使中华鳖精子的形态达到均质化状态，使得繁殖季节睾丸排出的不成熟或者形态不均质的精子在1
‑
30h内达到形态学均质化的状态，主要表现在精子的头部由肥大变为纤细状，可进一步应用于体外授精等细胞学操作，解决中华鳖精子发生时产生的形态学不均质问题。
附图说明
[0019]图1为本专利技术具体实施方式中取自中华鳖睾丸的不均质精液在显微镜下的精子形态图；
[0020]图2为本专利技术实施例1中处理后的精液在显微镜下的精子形态图；
[0021]图3为本专利技术实施例2中处理后的精液在显微镜下的精子形态图；
[0022]图4为本专利技术实施例3中处理后的精液在显微镜下的精子形态图。
具体实施方式
[0023]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本专利技术的具体实施例做详细的说明。需要说明的是，以下各实施例仅用于说明本专利技术的实施方法和典型参数，而不用于限定本专利技术所述的参数范围，由此引申出的合理变化，仍处于本专利技术权利要求的保护范围内。
[0024]需要说明的是，在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0025]如
技术介绍
所述，现有的中华鳖精子具有发生时产生的精子形态学不均质的缺陷，有鉴于此，本专利技术的具体实施方式提供一种中华鳖精子形态均质化的方法，可将中华鳖精子形态均质化时间缩短至1～30小时。具体步骤如下：
[0026]S1、孵育：取不均质精子与冰醋酸
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乙醇
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磷酸盐溶液混合，25℃孵育1～30小时；
[0027]S2、收集：取步骤S1中孵育完毕的混合液，离心机内以25℃、3000～5000rpm离心6～10分钟，收集沉淀后用杜氏磷酸盐溶液洗涤2～3次，所述洗涤方式为离心机内以25℃、3000～5000rpm离心6～10分钟，收集沉淀后依据实际情况重悬即可得到形态均质化的精子。
[0028]取自中华鳖睾丸的不均质精子在显微镜下的形态如图1所示，其头部较为肥大，且头部的整体弯曲不明显，图中标尺为50μm标尺。
[0029]实施例1
[0030]配制冰醋酸
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乙醇
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磷酸盐溶液：冰醋酸、无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司，磷酸盐缓冲液根据实际需要配制，所有试剂使用前均经过0.22μm滤膜过滤除菌处本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中华鳖精子形态均质化的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、孵育：取不均质精子与冰醋酸
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乙醇
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磷酸盐溶液混合，所述不均质精子为中华鳖睾丸排出的不均质精子，将混合液在15～25℃下孵育1～30小时；S2、收集：取步骤S1中孵育完毕的混合液，离心机内以25℃、3000～5000rpm离心6～10分钟，收集沉淀后用杜氏磷酸盐溶液洗涤2～3次，洗涤方式为离心机内以25℃、3000～5000rpm离心6～10分钟，除去上清液重悬即可得到形态均质化的精子。2.如权利要求1所述的一种中华鳖精子形态均质化的处理方法、乙醇、磷酸盐溶液的体积比为1：(2～4)：(5～8)，所述冰醋酸为有氧发酵法制备的食品级冰醋酸，乙醇为采用发酵生产的食品级酒精，纯度95％以上。3.如权利要求2所述的一种中华鳖精子形态均质化的处理方法，其特征在于，配制所述冰醋酸
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【专利技术属性】
技术研发人员：王伟，李彩燕，钱国英，尹尚军，吴家豪，王欣怡，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：