一种贻贝蛋白的生物转化生产方法技术

本发明专利技术公开了一种贻贝蛋白的生物转化生产方法，涉及基因工程、发酵工程与应用生物学领域，具体步骤为：(1)构建包含贻贝蛋白前体的工程菌株；(2)将所述工程菌株经过活化和扩大化培养后进行蛋白发酵表达，发酵结束后，破碎菌体，使用亲和层析柱纯化发酵产物，获得纯化产物；(3)将所述纯化产物加入复合转化酶体系，进行酶转化，酶转化结束后，使用亲和层析柱，分离纯化转化产物，将纯化产物冷冻干燥，溶于酸性溶液中，获得贻贝蛋白。整个贻贝蛋白合成及重组过程中，真核生物的表达量高，发酵液中目标产物浓度大，经酶法重组后贻贝蛋白的生物学活性与天然贻贝蛋白类似。活性与天然贻贝蛋白类似。活性与天然贻贝蛋白类似。

【技术实现步骤摘要】
一种贻贝蛋白的生物转化生产方法


[0001]本专利技术涉及基因工程、发酵工程与应用生物学领域，尤其是涉及一种贻贝蛋白的生物转化生产方法。

技术介绍

[0002]贻贝蛋白，作为一种源于自然界的天然粘性物质，具有优异的黏附性、柔韧性和良好的生物相容性，且毒性低，不会引发人体免疫反应等诸多优良性质。贻贝正是通过其足丝分泌的贻贝粘蛋白将自己固定在海水下的岩石、船体、缆绳、漂流瓶等固体表面上，形成抗水的结合，耐受风浪等的冲刷。通过对贻贝蛋白固化后形成的足丝的分离鉴定，当前得到四大类共11种蛋白质，分别是贻贝足丝蛋白：mfp
‑
1～6六种，胶原前体蛋白(Pre
‑
Collagen，Precol三种，一种足丝纤维近端基质蛋白(proximal matrix thread protein,PMTP)以及多酚氧化酶(polyphenol oxidase enzyme)。
[0003]贻贝蛋白具有广阔的应用领域，然而贻贝蛋白的大规模生产仍是一个未解决的难题。在医学领域，贻贝蛋白可用于烧伤、激光术后等皮肤损伤的修复及眼角膜、结膜、细小骨骼等的粘接；作为生物涂层，使金属材料具有更好的生物相容性；日用化妆品领域，贻贝蛋白可以在皮肤表面形成微观的纳米级保护膜，在物理性阻隔、抗氧化、局部抗炎的作用下，治疗痤疮凹陷性瘢痕，迅速修复创面肌肤，抑制瘙痒及黑色素沉着，让肌肤远离PM2.5颗粒；防腐涂料领域，贻贝蛋白耐海水耐盐雾，可以保护金属及微电子设备。
[0004]目前贻贝蛋白的生产方式主要有三种手段：一、从贻贝足腺中提取纯化，获得单一蛋白质产品，也是目前生产贻贝蛋白产品的主要手段。但由于贻贝足丝蛋白的分泌量极低，10000个贻贝才能提取到1mg的贻贝足丝蛋白，生产成本高、提取效率低，导致这种直接提取的产品价格高达每毫克2000元以上；二、足腺细胞体外培养。但由于无脊椎动物细胞培养困难，其培养仍属世界性难题，贻贝足腺细胞的传代培养及其建系一直未能成功；三、基因工程。目前实现了利用大肠杆菌与酿酒酵母的重组表达，但由于基因工程途径无法进行严格且复杂的糖基化修饰，尽管可以体外进行糖基化修饰，重组蛋白性质远不及天然蛋白。因此，提出一种贻贝蛋白的生物转化生产方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，针对目前生物转化生产方法获得贻贝蛋白价格高和产量低的问题，提供一种贻贝蛋白的生物转化生产方法，以酵母菌(Saccharomyces)作为基因工程出发菌株，经过基因工程改造的工程菌为发酵菌株，再配合复合酶转化体系获得具有天然性质的贻贝蛋白，为一种两步法生产贻贝蛋白的方法。本专利技术涉及的复合转化酶体系包含人体铜蓝蛋白、维生素C氧化酶、葡萄糖氧化酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、酪氨酸酶、漆酶、辣根过氧化物酶、SOD及醇脱氢酶。本专利技术的工艺体系涉及水相催化体系和非水相催化体系。该两步法主要包括工程菌株的构建、贻贝蛋白发酵表达与发酵产物的酶法转化纯化。
[0006]本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：
[0007]一种贻贝蛋白的生物转化生产方法，具体包括以下步骤：
[0008](1)根据贻贝蛋白前体表达菌株的密码子偏好性设计贻贝蛋白前体氨基酸序列的编码基因序列，将基因序列连接至PET28a载体上并转入大肠杆菌DH5α中，经过筛选扩培，抽提质粒并进行双酶切验证、回收，获得目的序列，将目的序列连接到载体质粒上，转化受体菌，获得工程菌株；
[0009](2)将所述工程菌株经过活化和扩大化培养后进行发酵表达，发酵结束后，破碎菌体，使用亲和层析柱纯化发酵产物，获得纯化产物；
[0010](3)将所述纯化产物加入复合转化酶体系，进行酶转化，酶转化结束后，使用亲和层析柱，分离纯化转化产物，将纯化产物冷冻干燥，溶于柠檬酸溶液中，获得贻贝蛋白。
[0011]进一步改进在于，所述贻贝蛋白前体表达菌株为酵母菌(Saccharomyces)，所述贻贝蛋白前体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]进一步改进在于，所述步骤(3)中的体系为水相转化体系或非水相转化体系。
[0013]进一步改进在于，所述非水相转化体系包括：无机相和复合转化酶；其中，所述无机相包括乙酸乙酯、二甲亚砜、甘油。
[0014]进一步改进在于，所述水相转化体系包括：水和复合转化酶。
[0015]进一步改进在于，所述所述步骤(3)中复合转化酶包括人体铜蓝蛋白、维生素C氧化酶、葡萄糖氧化酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、酪氨酸酶、漆酶、辣根过氧化物酶、SOD及醇脱氢酶。
[0016]进一步改进在于，所述复合转化酶系组成按质量比，包括以下任意一种：
[0017](1)辣根过氧化物酶:葡萄糖氧化酶:SOD酶＝1:1:2；
[0018](2)锰过氧化氢酶:SOD酶:酪氨酸酶＝1:2:2；
[0019](3)VC氧化酶:葡萄糖氧化酶:SOD酶＝2:2:1；
[0020](4)辣根过氧化物酶:锰过氧化氢酶:葡萄糖氧化酶＝2:1:3。
[0021]进一步改进在于，所述步骤(3)中复合转化酶系按照体系质量体积浓度的0.1
‰‑
20％添加，酶法转化时间为0.4
‑
18h。
[0022]进一步改进在于，所述步骤(3)中体系的pH为3.5～8.5，温度为35～65℃。
[0023]进一步改进在于，所述步骤(3)中所述纯化产物冷冻干燥后溶于1％柠檬酸溶液中。
[0024]本专利技术具有如下有益效果：
[0025]本专利技术方法使用了酵母真核生物表达系统，技术方便，可控性强；整个贻贝蛋白合成及重组过程中，真核生物的表达量高，发酵液中目标产物浓度大，经酶法重组后贻贝蛋白的生物学活性与天然贻贝蛋白类似。
附图说明
[0026]图1为本专利技术两步法生产贻贝蛋白技术路线图；
[0027]图2为氧化酶催化生成邻苯二酚的途径示意图；
[0028]图3为氧化酶催化苯酚邻位加成的自由基反应机制电子顺磁图谱；
[0029]图4为酶与底物及自由基中间体共结晶及键能三维结构示图。
具体实施方式
[0030]下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
[0031]1、材料
[0032]本实验所用所有试剂如无特殊说明均为常规试剂，均使用去离子水配制，所使用到的仪器均为实验室常规仪器。
[0033]2、方法
[0034]2.1工程菌株的构建
[0035](1)基因序列扩增
[0036]根据贻贝蛋白前体氨基酸序列SEQ ID NO.1(GenBank：AST36139.1)及其在酵母菌表达体系中的密码子偏好性原则，设计目的序列并合成DNA序列，以酵母菌(Saccharom yc本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种贻贝蛋白的生物转化生产方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)根据贻贝蛋白前体表达菌株的密码子偏好性设计贻贝蛋白前体氨基酸序列的编码基因序列，将基因序列连接至PET28a载体上并转入大肠杆菌DH5α中，经过筛选扩培，抽提质粒并进行双酶切验证、回收，获得目的序列，将目的序列连接到载体质粒上，转化受体菌，获得工程菌株；(2)将所述工程菌株经过活化和扩大化培养后进行发酵表达，发酵结束后，破碎菌体，使用亲和层析柱纯化发酵产物，获得纯化产物；(3)将所述纯化产物加入复合转化酶体系，进行酶转化，酶转化结束后，使用亲和层析柱，分离纯化转化产物，将纯化产物冷冻干燥，溶于1％柠檬酸溶液中，获得贻贝蛋白。2.根据权利要求1所述的一种贻贝蛋白的生物转化生产方法，其特征在于，所述贻贝蛋白前体表达菌株为酵母菌(Saccharomyces)，所述贻贝蛋白前体氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的一种贻贝蛋白的生物转化生产方法，其特征在于，所述步骤(3)中的体系为水相转化体系或非水相转化体系。4.根据权利要求3所述的一种贻贝蛋白的生物转化生产方法，其特征在于，所述非水相转化体系包括：无机相和复合转化酶；其中，所述无机相包括乙酸乙酯、二甲亚砜、甘油。5.根据权利要求3所述的一种贻贝蛋白的生物转化生产...

【专利技术属性】
技术研发人员：施昊，张义玲，罗学才，尹若春，
申请(专利权)人：安徽大学绿色产业创新研究院，
类型：发明
国别省市：