噻嗪酮半抗原、完全抗原和抗体的制备方法及应用技术

本发明专利技术首次提供了噻嗪酮半抗原、完全抗原和抗体的制备方法及应用，属于免疫分析技术领域。国内外有关噻嗪酮半抗原的结构设计和合成，抗体制备与免疫分析方法的建立均都尚处于研究空白。本发明专利技术提供的噻嗪酮半抗原可充分暴露噻嗪酮抗原决定簇于宿主动物免疫系统。本发明专利技术提供的完全抗原为由式I所示结构的化合物与载体蛋白偶联，得到噻嗪酮完全抗原。本发明专利技术制备的完全抗原被用于免疫宿主动物后，能够刺激机体产生高灵敏度的抗血清/抗体，制备得到的抗血清/抗体能够特异性识别噻嗪酮。本发明专利技术提供的抗血清/抗体可以用于建立噻嗪酮免疫学分析方法或检测试剂。本发明专利技术将为保障我国噻嗪酮在食品及农产品的残留提供强有力的技术支撑，具有广阔应用前景。具有广阔应用前景。具有广阔应用前景。

【技术实现步骤摘要】
噻嗪酮半抗原、完全抗原和抗体的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及免疫分析
，特别涉及噻嗪酮半抗原、完全抗原和抗体的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]噻嗪酮(Buprofezin)，又称扑虱灵，稻虱净，属昆虫生长调节剂类杀虫剂。化学式为2
‑
叔丁亚氨基
‑3‑
异丙基
‑5‑
苯基
‑
3,4,5,6
‑
四氢
‑
2H
‑
1,3,5
‑
噻二嗪
‑4‑
酮，CAS登记号：69327
‑
76
‑
0，分子式为：C
16
H
23
N3SO，相对分子量为305.4。纯品为白色晶体，熔点在104.5℃～105.5℃，相对密度1.18(25℃)。对酸、碱、光、热稳定。噻嗪酮分子结构式如下图所示。
[0003][0004]噻嗪酮属于杂环噻二嗪类昆虫生长调节剂，其作用机制为抑制昆虫壳多糖的合成和干扰昆虫的新陈代谢，由于其具有很强的触杀作用，可使若虫蜕皮畸形或翅畸形而后缓慢死亡，对于飞虱、叶蝉、粉虱和介壳虫类害虫均具有良好防治效果。主要用于水稻、果树、茶树、蔬菜等作物的害虫防治，对于鞘翅目、部分同翅目以及蜱螨目具有持效性杀幼虫活性。
[0005]噻嗪酮作为全球范围内最成功的昆虫生长调节剂类产品(IGRs)之一，能够有效防治同翅目害虫(如稻飞虱、粉虱、蚧壳虫等)，在全球超过80个国家和地区被广泛使用。噻嗪酮为几丁质合成抑制剂。由于作用机理独特、选择性强并且在推荐剂量下对有益生物安全，常作为轮换方案的必备药剂之一，广泛用于害虫综合治理(IPM)。在高毒农药品种禁用，常规农药品种抗性发展的当下，噻嗪酮迎来了新一轮的发展机遇。
[0006]目前，国内外有关噻嗪酮的半抗原结构设计和合成，抗体制备与免疫分析方法的建立均都尚处于研究空白。农药残留检测技术一直深受人们的关注，建立灵敏、准确、高效的农药残留检测方法一直以来是科研工作者所追求的目标。噻嗪酮持效期长的双刃剑将造成一系列环境问题。由于使用不当和生态循环造成的噻嗪酮农药残留与蓄积，其严重影响环境和生态安全，威胁人类健康。农药残留量超标仍然是影响我国食品及农产品质量与安全的重要因素。本专利技术所制备的半抗原、完全抗原和抗噻嗪酮抗体是建立免疫分析方法的基础。本专利技术所制备的具有高灵敏度的抗噻嗪酮抗体可被用于建立特异性识别噻嗪酮的免疫分析方法，这将为保障我国食品和农产品的噻嗪酮残留提供强有力的技术支撑。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术目的在于首次提供噻嗪酮半抗原、完全抗原、抗体的制备方法及应用。由本专利技术的噻嗪酮半抗原制得的完全抗原免疫宿主动物后得抗血清或抗体，具有高
灵敏度并能特异性识别噻嗪酮。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了噻嗪酮半抗原，具有式I所示结构：
[0010][0011]式I中，R1为
‑
(CH2)n
‑
COOH、
‑
(CH2)n
‑
OH、
‑
(CH2)n
‑
NH2、
‑
(CH2)n
‑
COOR2、其中m、n独立地为0～6的整数；
[0012]R2为
[0013]本专利技术提供了上述噻嗪酮半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0014]将5
‑
甲基
‑2‑
吡咯酮、盐酸和水混合，进行开环反应，得到具有式a所示结构的化合物；
[0015][0016]将所述具有式a所示结构的化合物、甲醇和酯化反应催化剂混合，进行酯化反应，得到具有式b所示结构的化合物；
[0017][0018]将所述具有式b所示结构的化合物、叔丁基异硫酸酯、无机碱催化剂和第一有机溶剂混合，进行取代反应，得到具有式c所示结构的化合物；
[0019][0020]将所述具有式c所示结构的化合物、无机强碱水溶液和第二有机溶剂混合，进行水解反应，得到具有式d所示结构的化合物；
[0021][0022]将N
‑
甲基甲酰苯胺、磺酰氯、偶氮类引发剂和第三有机溶剂混合，进行酰氯化反
应，得到具有式e所示结构的化合物；
[0023][0024]将所述具有式d所示结构的化合物、具有式e所示结构的化合物、无机强碱水溶液、相转移催化剂和第三有机溶剂混合，进行成环反应，得到具有式I
‑
1所示结构的噻嗪酮半抗原；
[0025][0026]将所述具有式I
‑
1所示结构的噻嗪酮半抗原、N
‑
羟基琥珀酰亚胺、碳酰二亚胺盐酸盐与第四有机溶剂混合，进行羧基活化反应，得到具有式I
‑
2所示结构的噻嗪酮半抗原；
[0027][0028]优选的，所述开环反应的温度为95～100℃，时间为7.5～8h；
[0029]所述酯化反应的温度为75～80℃，时间为5.5～6h；
[0030]所述取代反应的温度为20～25℃，时间为9.5～10h；
[0031]所述水解反应的温度为20～25℃，时间为5～5.5h。
[0032]优选的，所述酰氯化反应的温度为70℃～回流温度，时间为2.5～3h；
[0033]所述成环反应的温度为20～25℃，时间为8～8.5h。
[0034]本专利技术提供了噻嗪酮完全抗原，包括上述噻嗪酮半抗原和与所述噻嗪酮半抗原偶联的载体蛋白。
[0035]本专利技术提供了上述噻嗪酮完全抗原在制备噻嗪酮抗血清或噻嗪酮抗体中的应用。
[0036]本专利技术提供了抗噻嗪酮多克隆抗体、抗噻嗪酮单克隆抗体或抗噻嗪酮纳米抗体，由上述噻嗪酮完全抗原乳化后免疫宿主动物得到。
[0037]本专利技术提供了上述抗噻嗪酮多克隆抗体、抗噻嗪酮单克隆抗体或抗噻嗪酮纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0038]将噻嗪酮完全抗原乳化后免疫宿主动物；
[0039]将免疫宿主动物加强免疫后，采集免疫动物的全血，对血清进行分离和纯化，得到抗噻嗪酮多克隆抗体；
[0040]或者，从所述宿主动物中分离脾细胞，在体外将所述脾细胞与SP2/0瘤细胞融合后，筛选能够分泌抗噻嗪酮抗体的单克隆杂交瘤细胞株，基于所述单克隆杂交瘤细胞株制备抗噻嗪酮单克隆抗体；
[0041]或者，从宿主动物的外周血液中B淋巴细胞的IgG中提取mRNA用于纳米抗体文库的构建，在构建好的纳米抗体文库中进行纳米抗体的淘选，将淘选得到的纳米抗体的诱导表
达和纯化后，得到抗噻嗪酮纳米抗体。
[0042]本专利技术提供了检测噻嗪酮的试剂盒，包括上述抗噻嗪酮多克隆抗体、抗噻嗪酮单克隆抗体或抗噻嗪酮纳米抗体或上述制备方法制备得到的抗噻嗪酮多克隆抗体、抗噻嗪酮单克隆抗体或抗噻嗪酮本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.噻嗪酮半抗原，具有式I所示结构：式I中，R1为
‑
(CH2)n
‑
COOH、
‑
(CH2)n
‑
OH、
‑
(CH2)n
‑
NH2、
‑
(CH2)n
‑
COOR2、其中m、n独立地为0～6的整数；R2为2.权利要求1所述的噻嗪酮半抗原的制备方法，包括以下步骤：将5
‑
甲基
‑2‑
吡咯酮、盐酸和水混合，进行开环反应，得到具有式a所示结构的化合物；将所述具有式a所示结构的化合物、甲醇和酯化反应催化剂混合，进行酯化反应，得到具有式b所示结构的化合物；将所述具有式b所示结构的化合物、叔丁基异硫酸酯、无机碱催化剂和第一有机溶剂混合，进行取代反应，得到具有式c所示结构的化合物；将所述具有式c所示结构的化合物、无机强碱水溶液和第二有机溶剂混合，进行水解反应，得到具有式d所示结构的化合物；将N
‑
甲基甲酰苯胺、磺酰氯、偶氮类引发剂和第三有机溶剂混合，进行酰氯化反应，得到具有式e所示结构的化合物；
将所述具有式d所示结构的化合物、具有式e所示结构的化合物、无机强碱水溶液、相转移催化剂和第三有机溶剂混合，进行成环反应，得到具有式I
‑
1所示结构的噻嗪酮半抗原；将所述具有式I
‑
1所示结构的噻嗪酮半抗原、N
‑
羟基琥珀酰亚胺、碳酰二亚胺盐酸盐与第四有机溶剂混合，进行羧基活化反应，得到具有式I
‑
2所示结构的噻嗪酮半抗原；3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述开环反应的温度为9...

【专利技术属性】
技术研发人员：金茂俊，许灵媛，曹振，王静，金芬，佘永新，郑鹭飞，邵华，王珊珊，王淼，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：